高良姜葉枯病病原菌的分離和鑒定

陳旭玉 甘炳春 馮錦東

摘要 [目的]明確高良姜葉枯病病原菌。 [方法] 病原菌從高良姜感病組織上分離并依據(jù)柯赫氏法則進行致病性測定，病原菌的鑒定主要通過形態(tài)鑒定和ITS序列分析。[結果] 高良姜葉枯病病原菌確定為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），屬子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。 [結論]首次報道高良姜葉枯病病原菌為可可毛色二孢。

關鍵詞 高良姜；葉斑病； 可可毛色二孢

中圖分類號 S573 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05031-02

高良姜（Alpinia officinarum Hance）屬姜科山姜屬多年生草本植物，以根莖入藥，是一種常見的南藥[1]。其性熱、味辛，具有溫中、散寒、理氣、止痛的功效[2]。高良姜主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、臺灣、海南、云南等地，在海南陵水、萬寧、儋州等都有栽培[3-4]。海南種植的幾塊高良姜基地都發(fā)現(xiàn)葉枯病，嚴重影響了高良姜的發(fā)展。發(fā)病的葉片多從葉尖葉緣開始發(fā)病，病斑近圓形或不規(guī)則形，灰褐色，干斑病斑黃褐色，中央有灰白色，病健交界處有明顯的黃色暈圈和較寬的褐色分界線。嚴重者整個葉片變黃干枯（圖1）。目前國內(nèi)外尚未見對高良姜葉枯病的研究，為了明確葉枯病的病原菌和有效控制葉枯病的蔓延，筆者對高良姜葉枯病病原菌進行研究，旨在為高良姜葉枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從海南省萬寧市藥用植物研究所海南分所南藥園等多個地點采集具有典型癥狀的高良姜葉枯病病葉，組織分離法獲得菌株，純化后，轉入試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化。 將具有典型癥狀的高良姜葉片用清水清洗干凈，用75%乙醇浸泡1 min，用無菌水沖洗3～4次，再浸入10%次氯酸鈉中消毒2 min，用無菌水沖洗3～4次。用解剖刀切下病健交界處在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取形態(tài)不同的單菌落于新培養(yǎng)基上培養(yǎng)。采用瓊脂平板稀釋純化法進行純化，再將純化的菌株分別轉入試管斜面保存以供測定。

1.2.2 病原菌致病性測定。 將菌株的菌絲塊分別接種于健康無病的葉片，采用刺傷的接種方法，接種后保濕。以接種無菌的瓊脂塊作為對照，逐日觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)學觀察。將柯赫法則驗證后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，觀察菌落的顏色和形狀，用顯微鏡觀察分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)。

1.2.4 病原菌分子鑒定。使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因組試劑盒（DP320.02）進行真菌DNA提取，具體步驟參照其說明書。以真菌DNA為模板，ITS1/ITS4為引物進行PCR擴增。其序列為：擴增反應體系為：模板（真菌DNA） 0.5～1.0 μl，ITS1（10 μm）1 μl， ITS4（10 μm） 1 μl，2× Master Mix 12.5 μl，ddH2O 10 μl，PCR擴增程序為：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

2 結果與分析

2.1 病原菌的致病性 通過菌塊接種法，3 d后發(fā)現(xiàn)該病原菌浸染的高良姜表現(xiàn)出與田間發(fā)病植株相同的癥狀，并從中再次分離到該病原菌。而空白對照無癥狀出現(xiàn)（圖2）。

2.2 病原菌鑒定 高良姜葉枯病原菌序列與NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上相似序列比對結果表明，該菌株與Lasiodiplodia theobromae（JX275790）的序列相似性為99%，結合形態(tài)特征，將該病原菌鑒定為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。屬子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢屬（Lasiodiplodia），病原菌孢子形態(tài)見圖3。

3 結論與討論

目前對高良姜的道地性、化學成分、藥理作用等方面開

展了大量研究，但尚無高良姜病害的研究報道。為明確該病病原菌和有效控制病害的發(fā)生，該研究對病原菌進行分離并結合形態(tài)學特征和DNA分子序列將該病原鑒定為可可毛色二孢。可可毛色二孢是常見的病原菌之一，常引起枝枯病、裂皮病，褐腐病、果腐病等[5-9]，該研究首次報道高良姜葉枯病病原菌確定為可可毛色二孢，為有效防治該病害和深入研究提供基礎。

參考文獻

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