辣椒CaERF4的全長(zhǎng)cDNA克隆及其表達(dá)分析

蔡漢陽(yáng)等

摘 要 通過篩選辣椒均一化cDNA文庫(kù)，獲得一個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域的辣椒CaERF4全長(zhǎng)cDNA序列，含有一個(gè)編碼250個(gè)氨基酸序列的開放閱讀框，與擬南芥等其它植物ERF蛋白之間有35%～38%的氨基酸序列相似性。該基因在辣椒不同器官中均有不同程度的組成型表達(dá)，在根系中表達(dá)量略低。此外，還發(fā)現(xiàn)CaERF4的轉(zhuǎn)錄受到茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）等外源激素處理以及青枯菌接種的誘導(dǎo)，但水楊酸（SA）處理作用不明顯，高溫處理也可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)。說(shuō)明CaERF4可能在辣椒應(yīng)答病原菌和高溫等逆境脅迫中起調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞 辣椒；乙烯響應(yīng)因子；轉(zhuǎn)錄活性；組織特異性；誘導(dǎo)表達(dá)

中圖分類號(hào) S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Full Length cDNA Cloning and Expressional

Characterization of CaERF4 of Capsicum annuum

CAI Hanyang1，XIAO Zhuoli1，YAN Yan2，GUAN Deyi2，HE Shuilin2*，WU Yang3*

1 College of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002，China

2 College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002，China

3 College of Life Science， Jinggangshan University， Jian， Jiangxi 343009，China

Abstract ERF（Ethylene Responsive Factor） is an important plant specific transcription factor family implicated in plant growth， development and response to environmental stresses. However， the structure and function of the major members in this family remain unknown， especially in non model plants such as Capsicum annuum. In the present study， a full length cDNA of putative ERF containing AP2 conservative domain was identified from randomly sequencing of a normalized cDNA library of pepper. This full length cDNA harbors an open reading frame encoding a protein of 250 aa in length sharing 35%-38% sequence identity to ERFs from other plant species. The putative ERF transcription factor was designated as CaERF4 due to its highest sequence identity to AtCRF4. By RT-PCR analysis， CaERF4 exhibited a constitutive transcriptional expression in different organs in pepper plants， and it was also found to be induced to different degree by exogenously applied ETH and MeJA as well as by inoculation of Ralstonia solanacearum and treatment of high temperature stress，but not by exogenous application of SA. These results implied that CaERF4 may play key roles in pepper response to R. solanacearum inoculation and heat stress treatment.

Key worlds Capsicum annuu；EPF；Transcriptional activity；Tissue specificity；Induced expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.011

植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境的應(yīng)答在很大程度上受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，各種轉(zhuǎn)錄因子在其中發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用。乙烯響應(yīng)因子（Ethylene Response Factor，ERF）轉(zhuǎn)錄因子屬于植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中有146個(gè)成員，在水稻中有136個(gè)成員[1]，初步的研究結(jié)果表明AP2/ERF家族成員與生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答環(huán)境脅迫等生物學(xué)過程密切相關(guān)，參與植物的生長(zhǎng)，花的發(fā)育，果實(shí)的成熟，葉片的衰老，以及植物應(yīng)答病原菌，低溫，干旱等過程的調(diào)控[2-3]。此外還發(fā)現(xiàn)AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子與水楊酸、茉莉酸、乙烯等多種信號(hào)通路相關(guān)[4-7]。例如，在煙草和番茄中過量表達(dá)TERF2/LeERF2可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗冷性。擬南芥AtERF1通過結(jié)合GCC盒激活PR基因表達(dá)，從而提高擬南芥對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性[8-9]。擬南芥過量表達(dá)AtERF14可通過上調(diào)ERF1、PDF1和Chi等防御反應(yīng)相關(guān)基因提高擬南芥對(duì)鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染的抗性[10]。番茄JERFs的表達(dá)與ET和 ABA 信號(hào)途徑相關(guān)，參與番茄耐鹽、耐旱、耐冷和抗病調(diào)控[11]。這些結(jié)果顯示出ERF家族成員在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中的重要作用。迄今關(guān)于ERF的研究大多數(shù)集中在擬南芥、水稻、番茄和煙草等少數(shù)作物的部分成員，人類對(duì)不同植物ERF家族的大多數(shù)成員的結(jié)構(gòu)和功能還所知甚少。

辣椒是一種中國(guó)重要的蔬菜和工業(yè)原料作物，其播種面積達(dá)130萬(wàn)hm2，僅次于大白菜，而產(chǎn)值居第一位。然而，辣椒也是一種土傳病害多，不耐連作的典型的茄科植物，生產(chǎn)上頻繁發(fā)生的病害及其它逆境容易導(dǎo)致其產(chǎn)量的降低和品質(zhì)的劣化，探索其抗逆的分子機(jī)制是促進(jìn)辣椒抗病抗逆遺傳改良的重要基礎(chǔ)性工作。迄今為止，有關(guān)辣椒ERF等轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道還不多。本研究通過辣椒均一化cDNA文庫(kù)測(cè)序，獲得一個(gè)含有AP2結(jié)構(gòu)域的辣椒ERF基因的全長(zhǎng)cDNA，含有保守的ERF和AP2結(jié)構(gòu)域，命名為CaERF4。初步研究表明該基因在辣椒不同器官上具有不同程度的組成型表達(dá)，且其轉(zhuǎn)錄表達(dá)也受到病原菌接種等誘導(dǎo)，表明該基因可能參與辣椒應(yīng)答病原菌侵染的防御反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒品種120#，由福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供并由本實(shí)驗(yàn)室保存；辣椒均一化文庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Green PCR Master Mix Kit（Roche）和RNA提取所用的Trizol均購(gòu)自大連寶生物TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 CaERF4全長(zhǎng)cDNA的獲得和序列分析 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建辣椒葉片均一化cDNA文庫(kù)，從中任意挑選1 000個(gè)單克隆送到華大基因測(cè)序公司測(cè)序，用blastp進(jìn)行蛋白質(zhì)比對(duì)和DNAMAN軟件對(duì)所有的測(cè)序結(jié)果，從中獲得CaERF4基因的全長(zhǎng)cDNA序列；并對(duì)該目標(biāo)序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析和研究。

1.2.2 植物材料的處理 將辣椒種子播種在基質(zhì)土中，放置在28 ℃的溫室中，待萌發(fā)長(zhǎng)成小苗后，重新移種到10 cm寬的塑料缽中培養(yǎng)，成長(zhǎng)到6片葉子（子葉除外）時(shí)期。然后挑取大小差不多一致的辣椒苗進(jìn)行激素、病原菌接種以及高溫處理。分別用100 μmol/L乙烯利（ETH）、1 mmol/L水楊酸（SA）、100 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)辣椒小苗進(jìn)行處理，每個(gè)1 h噴曬葉片1次，用水作為對(duì)照。分別在處理后0、1、3、6、12、24、48 h時(shí)，進(jìn)行采樣，放置液氮中保存，并放置于-80 ℃的冰箱中，用于提取mRNA。用43 ℃作為高溫處理，用沒有處理正常的28 ℃作為對(duì)照，然后在處理后0、1、3、6、12、24、48 h的時(shí)間點(diǎn)采用，保存用于提取mRNA。青枯菌接種處理，用本實(shí)驗(yàn)室保存的青枯菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)，用10 mmol/L的MgCl2重懸至OD600=0.8，用無(wú)菌的注射器注射辣椒葉片，在處理后0、2、6、12、24、36、48、72、96 h時(shí)采樣并保存，用于提取mRNA。同時(shí)，采取6葉期辣椒幼苗的根、莖、葉以及辣椒開花時(shí)的花和綠果放置于-80 ℃的冰箱中，用于提取mRNA。

1.2.3 mRNA的提取及RT-PCR和qPCR分析 采用Trizol法提取辣椒葉片及其根、莖、花和果等組織的總RNA，PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成單鏈的cDNA，作為模板，用于RT-PCR和qPCR分析用。設(shè)計(jì)一對(duì)特異性RT-PCR擴(kuò)增引物F： 5′-TAGATGTAGTGTGTTGTAC GGGGGCTA-3′和R：5′-CTCACAAAGTCCACCGAT

GAATAGACTAC-3′。PCR體系為25 μL：10×Exbuffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Ex Taq 酶0.2 μL， cDNA模板1 uL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 4 min； 94 ℃ 1 min； 60 ℃ 45 s； 72 ℃ 1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。qPCR分析采用實(shí)驗(yàn)室建立和采用體系[12-14]進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL：2×SYBR 5 μL，引物各0.2 μL，模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaERF4全長(zhǎng)cDNA序列分析

從辣椒葉片均一化cDNA文庫(kù)測(cè)序中獲得一個(gè)長(zhǎng)度為1 545 bp的陽(yáng)性克隆，其中含有5′端的非編碼區(qū)399 bp、3′端非編碼區(qū)393 bp和一個(gè)長(zhǎng)度為753 bp開放讀碼框（ORF），其推定蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為250個(gè)氨基酸殘基（圖1），分子量為28.3 ku。推定該蛋白質(zhì)氨基酸序列中具有一個(gè)長(zhǎng)度為55個(gè)氨基酸殘基的AP2 結(jié)構(gòu)域（102～156）和一段富含K、R氨基酸的類似核定位信號(hào)的堿性結(jié)構(gòu)域。通過NCBI中的BLASTP同源搜索結(jié)合DNAMAN軟件比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與其它植物的ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白具有35%～38%的氨基酸序列同源性（圖2～3）。由于與擬南芥AtCRF4的同源性最高，將其命為CaERF4。

2.2 CaERF4在辣椒不同器官中表達(dá)分析

提取辣椒成熟植株根、莖、葉、花、果的總RNA，進(jìn)行CaERF4表達(dá)的半定量RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaERF4在葉、花、綠果、根和莖中均具有不同程度的組成型表達(dá)，在根中的表達(dá)量略低（圖4）。

2.3 CaERF4在青枯菌接種、高溫及外源激素處理下的表達(dá)分析

由圖5可知，在噴施SA后CaERF4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化不明顯；辣椒葉片在噴施ETH 6 h后表達(dá)量CaERF4明顯上調(diào)；MeJA處理后3 h以內(nèi)，CaERF4的表達(dá)量沒有明顯的變化，但6 h后CaERF4的表達(dá)量明顯上調(diào)，處理后48 h明顯下調(diào)；辣椒植株高溫脅迫下僅脅迫處理6 h CaERF4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯升高，其它時(shí)間點(diǎn)變化不明顯；辣椒葉片在青枯菌接種6 h前CaERF4的表達(dá)量沒有明顯的上調(diào)，但接種12 h后明顯上調(diào)，一直持續(xù)到72 h，96 h后又下降到處理前的水平。

3 討論與結(jié)論

乙烯作為植物內(nèi)源的植物激素，在植物中扮演很重要的作用，如植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答[2-3]。乙烯應(yīng)答因子ERF作為乙烯信號(hào)途徑中很重要的轉(zhuǎn)錄因子，在乙烯介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答起重要的作用[4]。本研究所獲得的辣椒ERF轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性克隆含有AP2保守功能域，與已分離和鑒定的其它植物ERF具有較高的同源性，推測(cè)該基因應(yīng)是辣椒ERF家族成員。

基因的表達(dá)與基因的功能是密切相關(guān)的。本研究表明，CaERF4在辣椒不同的器官中均表現(xiàn)出一定程度的組成型表達(dá)。這種組成型表達(dá)可能與該基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有關(guān)，其在不同器官中組成型表達(dá)水平的差異的可能生物學(xué)意義還有待于進(jìn)一步深入研究。植物對(duì)病害及其它非生物逆境脅迫的抗性一般都需要消耗物質(zhì)和能量，植物在沒遭受到逆境時(shí)關(guān)閉抗逆反應(yīng)，而在遭受逆境脅迫時(shí)啟動(dòng)抗逆反應(yīng)，這是在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成的一種對(duì)物質(zhì)能量經(jīng)濟(jì)有效抗逆策略。因此，與植物抗逆調(diào)控有關(guān)的基因往往表現(xiàn)出誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄表達(dá)的特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)CaERF4除了表現(xiàn)出不同程度的組成型表達(dá)外，在逆境脅迫青枯菌接種和高溫脅迫處理下還表現(xiàn)出誘導(dǎo)型表達(dá)，說(shuō)明該基因可能參與辣椒應(yīng)答病原菌侵染和耐高溫脅迫。有研究表明，SA、JA和ET等內(nèi)源激素介導(dǎo)的信號(hào)通路與植物應(yīng)答病原菌和高溫密切相關(guān)[15]，本研究發(fā)現(xiàn)CaERF4可不同程度地受到外源SA、JA和ET處理的誘導(dǎo)，表明該蛋白在參與調(diào)控辣椒應(yīng)答青枯菌和高溫等逆境脅迫過程可能受到SA、JA和ET信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。通過功能獲得或功能缺失研究CaERF4在辣椒應(yīng)答青枯菌侵染和高溫脅迫下的作用，可進(jìn)一步剖析其與SA、JA和ET信號(hào)通路的關(guān)系將有利于剖析辣椒抗青枯病和耐高溫互作的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] Toshitsugu Nakano1， Kaoru Suzuki1， Tatsuhito Fujimura， et al. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice[J]. Plant Physiol， 2006， 140（2）： 411-432.

[2] Bleecker A B， Kende H. Ethylene： a gaseous signal molecule in plants[J]. Annu Rev Cell Dev Biol， 2000， 16： 1-18.

[3] Alexander L， Grierson D. Ethylene biosynthesis and action in tomato： a model for climacteric fruit ripening[J]. J Exp Bot，2002， 53（377）： 2 039-2 055.

[4] Zarei A， Korbes A P， Younessi P， et al. Two GCC boxes and AP2/ERF-domain transcription factor ORA59 in jasmonate/ethylene-mediated activation of the PDF1.2 promoter in Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol， 2011， 75（4-5）： 321-331.

[5] Kizis D， Pages M. Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA-dependent pathway[J]. Plant J，2002， 30（6）： 679-689.

[6] Gu Y Q， Yang C， Thara VK， et al. Pti4 is induced by ethylene and salicylic acid， and its product is phosphorylated by the Pto kinase[J]. Plant Cell， 2000， 12（5）： 771-786.

[7] Zhang H， Huang Z， Xie B， Chen Q， et al. The ethylene-， jasmonate-， abscisic acid-and NaCl-responsive tomato transcription factor JERF1 modulates expression of GCC box-containing genes and salt tolerance in tobacco[J]. Planta， 2004， 220（2）： 262-270.

[8] Solano R， Stepanova A， Chao Q， et al. Nuclear events in ethylene signaling： a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1[J]. Genes Dev， 1998， 12（23）： 3 703-3 714.

[9] Berrocal-Lobo M， Molina A， Solano R. Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi[J]. Plant J， 2002， 29（1）： 23-32.

[10] Onate-Sánchez L， Anderson J P， Young J， et al. AtERF14， a member of the ERF family of transcription factors， plays a nonredundant role in plant defense[J]. Plant Physiol， 2007， 143（1）： 400-409.

[11] Yang H J， Shen H， Chen L， et al. The OsEBP-89 gene of rice encodes a putative EREBP transcription factor and is temporally expressed in developing endosperm and intercalary meristem[J]. Plant Mol Biol， 2002， 50（3）： 379-391.

[12] Dang F F， Wang Y N， Yu L， et al. CaWRKY40， a WRKY protein of pepper， plays an important role in the regulation of tolerance to heat stress and resistance to Ralstonia solanacearum infection[J]. Plant Cell Environ， 2013， 36（4）：757-774.

[13] Dang F， Wang Y， She J， et al. Overexpression of CaWRKY27， a subgroup IIe WRKY transcription factor of Capsicum annuum， positively regulates tobacco resistance to Ralstonia solanacearum infection[J]. Physiol Plant， 2014， 150（3）： 397-411.

[14] Wang Y， Dang F， Liu Z， et al. CaWRKY58， encoding a group I WRKY transcription factor of Capsicum annuum， negatively regulates resistance to Ralstonia solanacearum infection[J]. Mol Plant Pathol， 2013， 14（2）： 131-144.

[15] Afroz A， Ali G M， Mir A， et al. Application of proteomics to investigate stress-induced proteins for improvement in crop protection[J]. Plant Cell Rep， 2011， 30（5）： 45-63.

責(zé)任編輯：古小玲