豬細小病毒LAMP檢測方法的建立

陳星瑤 張子群 王曉龍

摘 要：豬細小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）屬于細小病毒科細小病毒屬，通常感染初產母豬后會發生流產、不孕、產死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病狀。該病廣泛存在于世界各地并在大多數豬場流行，中國PPV的感染也很廣泛。因此本研究針對VP2基因作為靶序列設計引物，旨在建立一種可快速、靈敏、特異地檢測PPV 的LAMP 檢測方法。

關鍵字：豬細小病毒；環介導恒溫擴增技術（LAMP）

Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplifi

-cation for Detection of Porcine Parvoviru

Chen Xingyao1， Zhang Ziqun2， Wang Xiaolong1*

（ 1.Center of Conservation Medicine & Ecological Safety， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang， 150040；

2. Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Harbin， Heilongjiang， 150000）

Abstract： Porcine Parvoviru（PPV） belongs to the genus of parvovirus and the family of parvovirus. It can infect primiparous sow and usually result to abortion， infertility， stillbirth， malformation， mummification and weaking piglet and so on. This disease is popular in most pig farms and is widespread around the world. Meanwhile Chinese PPV infection is also very extensive. We designed primers according to VP2 gene of PPV， and established a quick， sensitive and specific detection method of LAMP for PPV .

Keywords： Porcine Parvoviru； 1oop-mediated isothermal amplification（LAMP）

豬細小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）屬于細小病毒科細小病毒屬。豬細小病毒粒子直徑約18～26 nm，外觀呈三角形或圓形，沒有囊膜。成熟的病毒粒子基因組為單股負鏈DNA分子，大約5 000個堿基[1]。豬細小病毒主要引起豬繁殖障礙，通常會導致初產母豬發生流產、不孕、 產死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病狀發生[2， 3]。該病廣泛存在于世界各地并在大多數豬場流行，嚴重地影響著養豬業的發展。豬細小病毒在中國已經普遍存在和傳播。調查顯示中國很多地區均有PPV的感染，比如黑龍江省[4]、河南省[5]、華中地區[6]、湖北省[7]、廣西省[8]、廣東省[9]等地區均有細小病毒感染的報道。 因此急需建立一種快速、便捷、靈敏且特異地PPV檢測方法。

環介導恒溫擴增技術（LAMP，1oop-mediated isothermal amplification） 是2000 年由日本的Notomi 等人發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法[10]。該技術具有特異性高、操作簡便、反應快速、敏感性好、成本低廉等優點，在一些病原的檢測中已被廣泛應用[11， 12]。PPV有三種結構蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP3是VP2水解后的產物，而VP2完全重疊于VP1中。本研究根據LAMP的工作原理，以VP2基因為目標基因，在優化相關反應條件的基礎上，建立了適用于臨床應用的豬細小病毒LAMP檢測方法，以期為我國豬細小病毒的防控提供必要的技術方法。

1材料和方法

1.1病毒來源

豬細小病毒基因組、豬圓環病毒2型基因組、豬鏈球菌基因組、豬繁殖與呼吸綜合征基因組、豬水泡病病毒基因組、偽狂犬病毒基因組、豬瘟病毒cDNA、豬流感cDNA、口蹄疫O型cDNA、豬藍耳病cDNA由本單位分離并保存。

1.2主要試劑及儀器

Marker（DL2000，DL100）購自大連TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均購買自大連寶生物公司。Bst DNA聚合酶，瓊脂糖，甜菜堿，鎂離子購自購自NEB公司；其他常規試劑均為國產分析純。電子天平購自瑞士precisa公司；旋渦混合器購自北京金北德工貿有限公司；高速離心機和高速冷凍離心機均購自德國Kandro公司；PCR儀為美國Thermal Cycler公司的MJ—PTC200型；制冰機購自日本SANYO公司；微波爐購自海爾集團；DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀購自北京市六一儀器廠；紫外凝膠成像系統購自香港Gene公司；濕熱滅菌器購自日本SANYO公司；電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海齊欣科學儀器有限公司；冰箱購自三星公司。

1.3引物設計及制備

應用網上lamp引物設計軟件（PrimerExplorerV3）對VP2基因設計引物（圖 1）。從獲得的數百對引物中選擇評分較高的引物，將設計好的序列發送至南京金斯瑞生物工程有限公司進行5'端修飾合成。

1.4 豬細小病毒LAMP檢測方法的建立

豬細小病毒陽性樣本測序后測定濃度，分裝備用。

配制LAMP（2×）的反應緩沖液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 貯存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4 g，將上述試劑混合后加入ddH2O定容至900 mL，混勻后取900 μL。再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25 μL、dGTP 25 μL、dTTP 25 μL）。

配制LAMP引物混合物（100 uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μL Lamp的反應體系：Bst DNA 聚合酶1 μL，豬細小病毒DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反應緩沖液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反應條件優化

反應溫度優化：根據反應體系優化策略，設置4組實驗，分別為60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反應體系進行實驗，反應時間為1 h，結束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中進行分析。

反應時間優化：分別設置3個實驗組，時間分別為30 min，45 min和60 min，按1.4反應體系進行實驗，反應在62℃下進行，結束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中分析。

1.6 LAMP靈敏度檢測實驗

將前述提取的豬細小病毒DNA進行濃度測定，依次倍比稀釋成107～10-2個拷貝，按照1.4反應條件檢測豬細小病毒LAMP引物的靈敏性。

1.7 LAMP特異性檢測實驗

以豬圓環病毒2型，豬鏈球菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒、偽狂犬病病毒，豬瘟病毒、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、豬藍耳病病毒和水作為供試樣品，制備DNA或cDNA作為模板，按照建立的方法進行LAMP擴增，檢測豬細小病毒LAMP的特異性。

1.8染料可視化試驗

為進一步優化LAMP的反應條件，在LAMP反應結束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ熒光染料觀察陰性和陽性反應顏色的變化情況。

2 實驗結果與分析

2.1 LAMP反應條件優化

2.1.1溫度優化

豬細小病毒LAMP引物溫度優化實驗中，擴增60 min后核酸電泳檢測結果如圖2所示，其中60℃，62℃，64℃和66℃均有擴增條帶產生，陰性對

照無條帶產生，因此LAMP引物擴增溫度可選擇60℃，62℃，64℃和66℃中任一溫度。

2.1.2時間優化

豬細小病毒LAMP引物擴增在60℃下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結果（圖3）。其中擴增45 min、60 min后均有擴增條帶產生，30 min無條帶產生，因此可選擇LAMP反應的擴增時間為45 min。

2.2 LAMP靈敏度檢測實驗

豬細小病毒LAMP引物擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結果，擴增條件為60℃，擴增時間為45 min。如圖4所示：107～101個拷貝的模板均有特異性產物產生，其余無條帶產生，圖4可看出本研究所設計的LAMP引物在60℃下，擴增45 min之后最少可檢出10個拷貝的模板。

2.3 LAMP特異性檢測實驗

以豬細小病毒基因組為模板，使用LAMP引物在60℃下擴增45 min后核酸電泳檢測結果。由圖5可見，豬細小病毒LAMP引物特異性擴增出了豬細小病毒基因片段，而與其他病原并無交叉反應。

2.4染料可視化試驗

向LAMP引物擴增不同濃度梯度基因的反應產物管內加2 μL SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽性反應管顏色立刻變為黃綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化（圖6）。由此可見，LAMP 反應結果容易判定，臨床推廣。

3結論

豬細小病毒基因組有兩個主要的開放閱讀框架，其中3′端編碼結構蛋白（VP）。基因組共編碼3種結構蛋白即VP1、VP2、VP3[13]。VP2蛋白完全重疊于VPI中，占總衣殼蛋白的60%以上是構成病毒粒子的主要蛋白。在豬細小病毒 VP2蛋白的近N端有連續的9個甘氨酸，這種GGG樣的甘氨酸富集區折疊成A-螺旋結構，可能是產生VP3蛋白的切割位點[14]。豬細小病毒VP2基因在759～917位點有連續158個堿基是PPV所特有的，而且強毒株和弱毒株此段基因序列完全相同[1， 15]。所以本研究選取針對其結構蛋白VP2基因的保守序列，設計合成特異性引物。

LAMP是一種簡便、快速、準確的基因擴增技術，只需在恒溫條件下就能完成擴增反應，不需要特殊儀器設備，并且擴增結果可通過反應體系的濁度或加入染料來直觀判斷，在病原檢測方面呈現出良好的應用前景[10， 16]。LAMP技術可以保證擴增的高特異性和高效率，其依賴于能夠識別靶DNA 上6個特定區域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴增核酸，能從僅相差一個核苷酸的基因標本中找出相應靶序列進行擴增，根據擴增與否即可判斷目的基因是否存在。

綜合文中的試驗結果，LAMP 檢測技術為豬細小病毒基因的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強、敏感性高的檢測方法，可用于豬細小病毒臨床檢測，并具有非常良好的應用前景。（編輯：何芳）

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