不同飼養模式對雜交鹿血清MBL抗菌活性的影響

劉建博 鄭雪 宋百軍 李榮權 康偉 馬麗娟

摘要 [目的] 探索不同飼養模式對雜交鹿血清中MBL抗菌活性的影響。[方法] 采用平板計數法研究雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交F1代MBL的抗菌活性，探討MBL作為補體功能候選蛋白的可行性，分析MBL抗化膿感染創傷致病菌的活性。[結果] 放養模式試驗組抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性都顯著高于圈養模式試驗組、D-甘露糖試驗組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗組（P<0.05）。放養模式試驗組抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性對動物機體的保護作用具有顯著的生物學意義。[結論]該研究可為雜交一代肉用鹿的抗病高產育種工作提供一定的理論依據和基礎資料。

關鍵詞 飼養模式；雜交鹿；MBL；抗菌活性

中圖分類號 S825 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-09038-02

Effect of Different Feeding Modes on Serum of MBL Antibacterial Activity in Hybrid Deer

LIU Jian-bo，MA Li-juan et al

（Jilin Agricultural Science and Technology College， Jilin， Jilin 132101； Key Laboratory of Changbai Mountain Animal and Plant Resources' Utilization and Protection of Universities in Jilin Province， Jilin， Jilin 132101）

Abstract [Objective] The research aimed to the effects of different feeding modes on the antibacterial activity of MBL in the serum of hybridized deer. [Method] The antibacterial activity of MBL in hybridized F1 generation of Shuangyang Deer and Qingyuan Wapiti was determined by using plate counting method. The feasibility of taking MBL as functional candidate protein of complement was discussed. The antibacterial activity of MBL against pathogens caused by pyogenic infection and wound was analyzed. [Result] The antibacterial activities of MBL to Staphylococcus aureus and Escherichia coli in grazing mode group were significantly higher than those in captive mode group， D-mannose group and N-acetyl -D-glucosamine group（P<0.05）. The antibacterial activities to S. aureus and E. coli in grazing model group were of significant biological meaning for protecting the animal bodies. [Conclusion] The research could provide theoretical basis and basic data for disease-resistant and high-yield breeding of hybridized meat deer.

Key words Feeding mode；Hybrid Deer；MBL；Antibacterial Activity

鹿屬于野生動物，喜跑跳，尤其是幼齡鹿活動強度和范圍更大，因而導致化膿感染創傷的幾率很大。由于鹿的化膿感染創傷治療難度大，增加養鹿成本，并且致病微生物、殘留毒素和藥物殘留會影響鹿肉品質。雖然傳統的化膿感染創傷防治方法對創傷治療起到了一定作用，但很難控制化膿感染創傷的發生，同時也帶來了藥物殘留和耐藥菌株等問題。隨著免疫遺傳學的高速發展，從遺傳免疫角度尋找具有抗炎效應的候選蛋白已成為抗病育種的熱點。補體系統的先天性免疫應答功能對病原微生物有溶菌作用和調理作用，其免疫功能是通過特異性受體和分子間相互作用實現的^[1]。甘露糖結合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）是一種模式識別蛋白，由肝細胞分泌后進入血液的，屬于C型膠原凝集素（鈣依賴型凝集素）^[2]。MBL具有免疫活性，可以直接識別粘合多種病原微生物，能夠通過凝集素途徑激活補體。此外，MBL具有調理、中和及補體激活的功能，其抗菌作用高度依賴低聚體的聚集程度和糖識別域的成簇方向，并且糖識別域能效仿病原體表面結構而識別病原微生物^[2-5]。目前，尚未見到關于鹿MBL的相關報道。基于此，筆者采用平板計數法研究雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交一代肉用鹿MBL的抗菌活性，探討牛MBL作為補體功能候選蛋白的可行性，分析MBL抗化膿感染創傷致病菌的活性，旨在為雜交一代肉用鹿的抗病高產育種工作提供一定的理論依據和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清。

選擇圈養模式（吉林農業科技學院提供）和放養模式（吉林省九臺市安錫山鹿苑提供）12月齡的雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交一代鹿各10頭，采用長桿吹針方式對鹿進行麻醉，臀部肌注鹿眠寶3號（1.5～2.0 ml/頭），完全麻醉后頸靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心15 min分離血清，-20 ℃條件下保存待測。采血后，每頭試驗鹿注射鹿醒寶1.5～2.0 ml催醒（靜脈和肌肉注射各半）。

1.1.2 細菌。

由中國獸醫藥品監察所提供大腸桿菌（革蘭氏陰性菌，E.coli ATCC35218）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌，S.aureus ATCC29213）。

1.1.3 MBL特異性抑制劑。N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-甘露糖。

1.1.4 綿羊血。抗凝脫纖維綿羊血-用于制作血瓊脂平板。

1.2 方法

1.2.1 分組。先按菌種分成不同處理，分為金黃色葡萄球菌處理（革蘭氏陽性菌）和大腸桿菌處理（革蘭氏陰性菌），每個處理又分為：①放養模式試驗組：放養模式飼養的12月齡F1代鹿個體血清10個；②圈養模式試驗組：圈養模式飼養的12月齡F1代鹿個體血清10個；

③D-甘露糖試驗組：樣本為放牧模式飼養的12月齡F1代鹿個體血清10個；④N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗組：樣本為放牧模式飼養的12月齡F1代鹿個體血清10個。

1.2.2 抗菌活性的測定。

將金黃色葡萄球菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液（106 CFU/ml PBS）分別與放養模式試驗組、圈養模式試驗組、D-甘露糖試驗組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗組的鹿血清混合（200 μl，1∶1）置于高壓滅菌過的EP管中，其中D-甘露糖試驗組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗組的鹿血清分別先與25 mmol/L D-甘露糖和50 mmol/L N-乙酰基-D-葡萄糖胺在5% CO₂和37 ℃的條件下反應30 min后再與菌液混合；將密封后的EP管置于37 ℃和5% CO₂的培養箱中反應24 h；再將每個完成反應的樣本用PBS稀釋105倍后均勻涂于平板上（大腸桿菌涂LB瓊脂平板，金葡菌組涂血瓊脂平板），每個樣本重復3次；同樣，將每個血平板置于37 ℃、5% CO₂的培養箱中培養24 h（30 min后將平板倒置）；最后，采用平板計數法對每個平板的CFU計數。

1.3 數據統計與分析

使用SPSS 17.0的一維方差分析程序按金黃色葡萄球菌組和大腸桿菌組對試驗數據分別進行統計與分析。

2 結果與分析

從圖1可以看出，放養模式試驗組的抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性都顯著高于圈養模式試驗組、D-甘露糖試驗組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗組（P<0.05）。試驗表明，放養模式試驗組的抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性對動物機體的保護作用具有顯著的生物學意義；圈養模式試驗組則是有患病傾向的。

3 討論

鹿化膿感染創傷主要是由微生物病原菌感染所致，特別是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，約占鹿化膿感染創傷比例的74%^[6]。這些病原菌主要是由于挫傷嚴重、創內搓滅組織和血塊較多、塵土、異物將細菌帶入或因對新鮮污染創治療不及時、處理不當而造成的^[7]。

人MBL與真菌^[8]、病毒^[8-11]和細菌^[12-13]的感染幾率相關，動物機體易感染重癥肺炎和系統傳染病等疾病在很大程度上是由于凝集素變化引起的^[14]。小鼠MBL與抗金黃色葡萄球菌活性顯著相關^[15]，豬MBL與豬抵抗豬鏈球菌和豬環狀病毒能力顯著相關^[16]，水牛對布氏桿菌的抗性與MBL顯著相關^[17-19]。這說明不同的補體成分與動物機體對細菌、病毒和寄生蟲的抵抗力顯著相關。Lillie等^[20]和Brooks等^[21]研究表明豬MBL有粘合細菌的功能。劉建博等研究表明MBL與奶牛對乳腺炎抗性相關^[22-23]。

綜上所述，鹿MBL具有抗菌功能，放養模式個體對創傷致病菌具有顯著抗性，而圈養模式個體為易感者，所以放養模式對鹿的健康有益，建議雜交肉用鹿采取圍欄放養模式進行飼養。

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