正交設計研究山牡荊總黃酮提取工藝

代現平，班翠紅，韓景田

摘要[目的]建立山牡荊總黃酮的合理提取工藝，為山牡荊的開發及利用提供理論依據。[方法]以乙醇用量、乙醇濃度、提取時間和提取次數等為考察因素，以山牡荊總黃酮含量作為指標，應用正交試驗對提取工藝進行優化。[結果]山牡荊中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇用量12倍量、乙醇濃度70%乙醇、提取次數3次、每次1 h。[結論]該提取工藝簡單、高效，適用于山牡荊的總黃酮提取。

關鍵詞 山牡荊；總黃酮；正交試驗；提取工藝

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07748-02

基金項目國家自然科學基金資助項目（31170320）。

作者簡介 代現平（1970-），男，河南鶴壁人，副教授，博士，從事天然活性成分研究。

收稿日期20140702牡荊屬植物Vitex是馬鞭草科喬木或灌木，全世界大約有250余種，主要分布在熱帶及溫帶地區。在我國有14種，主要分布于長江以南，在東北、西北、華北等地也有少量分布[1]。山牡荊（Vitex quinata）一般以其樹干心材和干燥根入藥，具有止咳定喘、清熱解毒及鎮靜退熱等功效，常用于癰腫瘡瘍、溫病發熱、風濕熱痹、關節紅腫熱痛及熱毒血痢等病癥[2]。研究顯示，山牡荊及牡荊屬植物主要含有黃酮類、苯丙素類、甾類、環烯醚萜類、三萜類、二萜類、倍半萜類等化學成分[3-8]。其中黃酮類化合物，因其廣泛的生物活性已成為研究的熱點。現代藥理研究證實，山牡荊的黃酮類成分具有如抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、增強機體免疫力、止咳祛痰等多種藥理作用[3-8]。因此，研究山牡荊中總黃酮的提取工藝具有重要意義。筆者以山牡荊總黃酮作為考察指標，采用正交設計試驗進行提取工藝的優化，對影響提取的各種條件及因素進行了深入探討，為山牡荊總黃酮提取工藝的研究及山牡荊總黃酮開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 山牡荊（煙臺綠葉制藥，經濱州醫學院藥學院天然藥物實驗室鑒定為真品）；對照品蘆丁（中國藥品生物制品檢定所）；其他試劑為分析純試劑。

1.2儀器 JA5003B電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；SHZⅢ循環水式多用真空泵（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）；TU190紫外可見分光光度計（北京普析通用）；HH6型恒溫水浴鍋（上海喬躍電子有限公司）；DHG9053型真空干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）；RE301旋轉蒸發儀（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備方法。準確稱取山牡荊粗粉30 g，于1 000 ml燒瓶中，按要求加入提取溶劑，加熱回流提取一定時間，過濾，減壓回收溶劑，干燥，稱重，得山牡荊干膏。精密稱取在不同提取條件下所得山牡荊干膏10 mg，于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后備用。

1.3.2 標準品溶液制備方法。精密稱取于120 ℃干燥至恒重蘆丁對照品10 mg，于100 ml容量瓶中，加60%乙醇30 ml，水浴微熱使溶，放冷，60%乙醇定容至100 ml，制成0.100 mg/ml蘆丁對照品溶液。

1.3.3 標準曲線制備。分別精密吸取蘆丁對照品溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml，分別于25 ml容量瓶中，各加0.75 ml亞硝酸鈉溶液（50 mg/ml），搖勻，靜置7 min；再加0.75 ml硝酸鋁溶液（100 mg/ml），搖勻，靜置7 min；再加10 ml氫氧化鈉溶液（40 mg/ml），60%乙醇定容，搖勻，靜置8 min。于510 nm波長處測吸光度，以吸光度A為縱坐標、蘆丁濃度C為橫坐標，進行線性回歸，計算回歸方程。

1.3.4 精密度試驗。 精密吸取2.0 ml蘆丁對照液于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法，重復操作5次。

1.3.5 穩定性試驗。取適量供試品溶液，按“1.3.3”方法，于0、2、4、6、8 h分別測定吸光度。

1.3.6 重復性試驗。取同一批藥材，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，并按“1.3.3”所述方法測定吸光度，重復5次。

1.3.7 回收率試驗。精密移取6份已知含量供試品溶液各0.5 ml，均精密加入蘆丁標準品溶液，按“1.3.3”方法測定其吸光度，計算山牡荊總黃酮含量。

1.3.8 供試品總黃酮含量測定。精密移取5 ml供試品溶液，于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法測吸光度，并代入回歸方程，計算總黃酮的含量。

1.3.9 正交試驗。應用正交試驗設計，選擇了乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取次數（C）和提取時間（D）作為考察因素，每個因素選擇了3個水平（），以總黃酮含量作為考核指標，按照L9（34）正交設計方案進行試驗。

2 結果與分析

2.1 山牡荊中總黃酮的含量測定經計算，以吸光度A為縱坐標、蘆丁濃度C為橫坐標的標準曲線的回歸方程為A=12.473C+0.001 9（r=0.999 6），表明蘆丁在0.005～0.049 mg/ml濃度范圍與其吸光度呈良好線性關系。精密度試驗結果顯示，5次吸光度值的相對標準偏差（RSD）為0.53%，表明該方法有良好精密度。穩定性試驗發現，5次吸光度值的RSD為1.36%，表明在8 h內測定供試品基本穩定。重復性試驗中5次吸光度值的RSD為1.73%；回收率試驗得出平均回收率97.59%，RSD=1.55%，表明該方法有良好重現性。

2.2 山牡荊總黃酮提取工藝優化

2.2.1 正交試驗。極差分析表明（），影響山牡荊總黃酮的提取主次因素依次為B>A>C>D，即乙醇用量>乙醇濃度>提取次數>提取時間；方差分析（）顯示，乙醇濃度、乙醇用量對結果影響具有極顯著性的意義，提取次數對試驗結果影響有顯著意義。正交設計結果（）顯示，提取工藝A1B2C3D2為最佳，但D因素影響小，且3個水平相差不大，為了節省能源，選用D1。因此，最佳工藝確定為70%乙醇12倍量加熱回流提取3次，每次1 h。

2.2.2 工藝驗證試驗。采用篩選后得到的最佳工藝，即A1B2C3D1提取3次，進行了驗證試驗，按“1.3.3”方法測吸光度，計算總黃酮的含量。結果發現，3批山牡荊總黃酮的含量分別為40.32、39.02、39.56 mg/g，相對標準偏差RSD=1.65%（n=3），表明該工藝路線是穩定可靠的。

3 結論

筆者曾進行了山牡荊藥材粒度、提取時間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數單因素的篩選試驗，結果顯示山牡荊粒度對提取效率的影響不大，因此選擇對提取效率有較大影響的乙醇濃度、提取時間、提取次數、乙醇用量為考察因素，進行正交試驗，優選其最佳提取工藝條件。經正交設計結果分析及方差分析，發現影響山牡荊總黃酮提取主次因素依次為乙醇用量>乙醇濃度>提取次數>提取時間，經綜合各種因素后，選定A1B2C3D1為山牡荊總黃酮的最佳提取方案，即70%濃度12倍量乙醇經加熱回流提取3次，每次1 h，按此條件提取，總黃酮含量較高。并按照最佳提取條件進行了驗證試驗，結果表明該提取工藝方法簡單、高效、穩定。

參考文獻

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