貴州鳳崗富鋅富硒綠茶對(duì)小鼠抗氧化抗衰老作用的研究

劉華　申雪慧子　聶蘭等

摘要

[目的]采用分子生物學(xué)技術(shù)，探討貴州鳳崗富鋅富硒綠茶對(duì)小鼠抗氧化、抗衰老的作用及機(jī)制。[方法]腹腔注射D半乳糖建立小鼠衰老模型，空白組給予腹腔注射0.9%生理鹽水。造模14 d后，根據(jù)中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦每日飲茶量及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物劑量比例，給小鼠灌胃富鋅富硒綠茶，1次/d。連續(xù)灌胃21 d后，采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。處死小鼠，采用蛋白免疫印跡法（westernblotting）檢測(cè)各小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）的表達(dá)。采取RTPCR法，測(cè)定各小鼠肝臟組織中SOD和GSHPx的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。[結(jié)果]富鋅富硒綠茶對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用，并且提高SOD和GSHPx的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平（P<0.01）。[結(jié)論] 富鋅富硒綠茶提高機(jī)體的抗氧化能力及免疫功能，在一定程度上具有延緩衰老的作用。

關(guān)鍵詞富鋅富硒綠茶；抗氧化；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的表達(dá)；小鼠衰老模型；肝臟組織

中圖分類(lèi)號(hào)S571文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09657-04

Study on Influence of Seenriched and Zincenriched Green Tea on Antioxidation and Antiaging of Mice in Guizhou

LIU Hua1， SHEN Xuehuizi1， NIE Lan2， WU Ning3*

（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 2. School of Public Health， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 3. Laboratory of Chemical and Biological Chemistry， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004）

Abstract[Objective] This paper focused on discussing how the Seenriched and Zincenriched green tea works on mice in antioxidation and antiaging by measuring the mRNA and protein expression level of SOD and GSHPx in liver tissue. [Method] The mice aging model was constructed by intraperitoneal injection of Dgalactose， compared with intraperitoneal injection for control group. 14 days later， the experimental mice were fed with tea solution by intragastric administration according to the daily amount of drinking tea and drug dose ratio of experimental animals recommended by Chinese Nutrition Institute. After 3week gavage， the behavior test was conducted through Morris water maze method. The mRNA expressional level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by RTPCR. The protein expression level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by westernblotting. [Result] The Se & Zincenriched green tea can exert a good influence on the improvement of the aging mices learning and memorizing ability. Meanwhile， Se & Zincenriched green tea can increase mRNA and protein expression levels of SOD and GSHPx. [Conclusion] Drinking Se & Zincenriched can improve the antioxidant capacity of mice and to an extent can slow down the aging process.

Key wordsSe & Zincenriched green tea； Antioxidant； Expression of SOD and GSHPx； Mice aging model； Liver tissue

貴州為我國(guó)綠茶的主要省份，而鳳岡產(chǎn)茶歷史悠久。唐代茶圣陸羽在他撰寫(xiě)的世界第一部茶書(shū)《茶經(jīng)》八之出中記述：“黔中生思州、播州、費(fèi)州、夷州……， 往往得之，其味極佳”。據(jù)考證，夷州治所就是今鳳岡縣綏陽(yáng)鎮(zhèn)。宋代《華陽(yáng)國(guó)志》中“平夷產(chǎn)茶蜜”，樂(lè)史《太平寰宇記》“夷州、播州、思州以茶為貢”和清代《梅移隨筆》“龍泉產(chǎn)云霧芽茶，色味雙絕”中的夷州、思州、龍泉都是指今鳳岡一帶[1]。最新科學(xué)研究表明，富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質(zhì)成分對(duì)防衰老、防癌、抗癌、殺菌、消炎等均有特殊效果，為其他茶類(lèi)所不及[2]。筆者通過(guò)測(cè)定肝臟組織中SOD和GSHPx的mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平，研究富鋅富硒綠茶對(duì)D半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，為貴州特色茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和推廣提供營(yíng)養(yǎng)保健的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1

動(dòng)物。昆明雄性小鼠70只，體重（18～25 g），購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心（合格證：10000S38）。

1.1.2

藥物。供試富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村所產(chǎn)，2013年春季采摘。經(jīng)貴州省山地研究所測(cè)試中心測(cè)定，該綠茶含鋅、硒含量分別是65.47±0.02、1.74±0.02 mg/kg。按茶水比為2 g∶20 ml的比例，用沸水沖泡30 min制成茶水，過(guò)濾，為高濃度組；稀釋1倍過(guò)濾后為中濃度組；再量取等體積水稀釋?zhuān)^(guò)濾后為低濃度組；普通綠茶泡制方法同前；維生素C片劑，用濃度0.9%生理鹽水配制成 50 g/ml溶液。

1.1.3

試劑。D半乳糖由上海恒信化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根，批號(hào)DP121221）；Thermo試劑盒（Fermentas公司）；6×DNA電泳Loading Buffer上樣液（天根，批號(hào)BC110413）；溴化乙錠（EB）溶液（天根，批號(hào)BC120227）；DNA marker（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)CW0632）；濃度30%丙烯酰胺（賽蘭博，批號(hào)8080）；1.5 mol/L Tris（pH 8.8）；1.0 mol/L Tris（pH 6.8）；濃度10%SDS；濃度10%過(guò)硫酸胺（APS）；TEMED；BAC法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；兔抗小鼠SOD1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號(hào)sc11407）；兔抗小鼠GSH1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號(hào)sc292189）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，批號(hào)sc2004）。

1.1.4

儀器。凝膠成像分析儀（美國(guó)BioRad公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），電泳儀（美國(guó)BioRad公司），3k15高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），T148 050900型PCR儀（德國(guó)Biometra公司），水平電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)BIORAD公司），DolphinDoc凝膠成像系統(tǒng)和DolphinID軟件（美國(guó)Wealtec公司），高壓滅菌鍋（日本三洋公司），MP200A型電子天平（上海良平儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），Morris水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所），動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡記錄分析系統(tǒng)（普升科技有限公司），HPLAS2000計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（無(wú)憾千屏公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

動(dòng)物衰老模型的構(gòu)建。用濃度75%乙醇消毒小鼠下腹部，用D半乳糖（0.2 mg/g小鼠體重）腹腔注射，連續(xù)14 d，誘發(fā)衰老模型，之后連續(xù)28 d每日給予相同劑量以維持衰老模型[3-4]。空白組小鼠注射濃度0.9%生理鹽水（0.1 ml/10 g小鼠體重），給藥方法同模型組。

1.2.2

行為學(xué)測(cè)試（游泳水迷宮試驗(yàn)）。在連續(xù)灌胃21 d后，采用環(huán)形水池。水池中放一低于水面1 cm左右的逃避平臺(tái)。模型小鼠預(yù)先訓(xùn)練4 d，每次取1、2、3、4四個(gè)象限入水點(diǎn)背對(duì)站臺(tái)放入水池。若小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，則使其停留15 s；若60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其誘導(dǎo)到平臺(tái)上，并停留15 s方結(jié)束一次訓(xùn)練。連續(xù)訓(xùn)練4 d，在第5天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，其檢測(cè)指標(biāo)有：①定向航行試驗(yàn)，測(cè)定每只小鼠從放入水中開(kāi)始到跳到逃避平臺(tái)時(shí)的時(shí)間，即逃避潛伏期；②空間探索試驗(yàn)，測(cè)定每只小鼠穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間及穿越站臺(tái)次數(shù)[5-6]。

1.2.3

分組與給藥。小鼠分為空白組、衰老模型組、普通綠茶組、富鋅富硒綠茶（高、中、低劑量）組、陽(yáng)性對(duì)照組（維生素C片），每組10只小鼠。 給藥方案為：給予D半乳糖（0.2 mg/g）14 d后，普通綠茶組給予普通綠茶茶水灌胃；富鋅富硒綠茶組按照高、中、低濃度進(jìn)行灌胃；模型組、空白組給予等容積蒸餾水灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃1 g/L維生素C溶液，1次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.2.4

小鼠肝臟組織SOD、GSHPx蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)。提取肝臟組織總蛋白，取少量上清液進(jìn)行蛋白定量，余下-20 ℃保存?zhèn)溆茫颇z，然后取20 μl蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液，煮沸變性后進(jìn)行SDSPAGE電泳；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含濃度5%脫脂奶粉的TBST振蕩封閉2 h；分別加入適量一抗4 ℃封閉過(guò)夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min；加二抗，室溫振搖孵育2 h；洗膜后ECL法顯影。以βactin為內(nèi)參，條帶經(jīng)Kodok Digital Science ID Image Analysis Software及GDS1數(shù)字化凝膠成像分析儀掃描，計(jì)算吸光度（A）。

A比值=目的蛋白A/βactinA

式中，A比值為目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5

小鼠肝臟組織SOD、GSHPx mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，提取后取5 μl RNA對(duì)RNA純度、濃度進(jìn)行檢測(cè)（提取方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。

RTPCR引物設(shè)計(jì)依據(jù)昆明小鼠中的SOD和GSHPx mRNA序列和βactin mRNA序列設(shè)計(jì)，經(jīng)blast進(jìn)行特異性確定。最后，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。SOD mRNA上游引物：5CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT3，下游引物：5CACCTTTGCCCAAGTCATCTT3。該引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為221 bp。GSHPx mRNA上游引物：5GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA3，下游引物：5AGTTGCCAGACTGCTGGGACA3。該引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為269 bp。βactin mRNA上游引物：5ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3，下游引物：5AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3。該引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為541 bp。

將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄（RTPCR）成cDNA，方法參考Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)。然后，以cDNA為模板，以SOD、GSHPx和βactin引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 6 μl，2×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下內(nèi)參各1 μl，模板2 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物在PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳，結(jié)果掃描保存。

1.2.6

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用單因素方差分析和多重比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠衰老模型驗(yàn)證

2.1.1

小鼠外觀。研究表明，空白組小鼠體質(zhì)量正常增加；模型組小鼠從造模第28天開(kāi)始，體重增加速度下降，部分毛發(fā)脫落、失去光澤，出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、精神萎靡不振等癥狀；富鋅富硒綠茶高劑量組小鼠精神狀態(tài)好于普通綠茶組；富鋅富硒綠茶中劑量組小鼠精神一直良好，毛發(fā)光滑整齊，體重增長(zhǎng)速度正常；富鋅富硒綠茶低劑量組小鼠精神狀態(tài)略好于高劑量組小鼠；普通綠茶組小鼠表現(xiàn)與空白組相似；陽(yáng)性組小鼠表現(xiàn)與中劑量組相似。

2.1.2

小鼠血清驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)比模型組與空白對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中 MDA含量在0.05水平顯著升高，而血清中 SOD 活力、GSHPx活力、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力顯著降低。

2.1.3

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果。由表1可知，在定向航行試驗(yàn)中，與空白組相比，模型小鼠所用的逃避潛伏期較長(zhǎng)（P<0.01）；普通綠茶組所用的逃避時(shí)間與空白組相差不大（P>0.05）；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期較短（P<0.01）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組所用的逃避潛伏期與之相當(dāng)（P>0.05）；與模型組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）。在空間探索試驗(yàn)中，與空白組相比，模型組第1次穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間延長(zhǎng)，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。普通綠茶組第1次穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)與空白組相差不大（P>0.05）； 與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組第1次穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間縮短，穿越站臺(tái)次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組第1次穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)與之相差不大（P>0.05）；與模型組相比，富鋅富硒綠茶組第1次穿越平臺(tái)區(qū)所用時(shí)間縮短，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯增多（P<0.01）。

3 討論

富鋅富硒綠茶中含有鋅和硒2種微量元素。鋅元素是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的輔基；硒元素是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的必需成分，每摩爾GSHPx含有4 g硒原子[7-8]。因此，富鋅富硒綠茶可以為機(jī)體抗氧化物質(zhì)提供豐富的原材料。

研究表明，SOD 和GSHPx是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中2種重要的抗氧化酶。其中，SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能夠有效清除自由基，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。趙會(huì)杰等[9]通過(guò)D半乳糖所致衰老小鼠飼喂SOD蘋(píng)果，發(fā)現(xiàn)可顯著提高小鼠血清和肝臟組織的SOD、CAT和GSHPx活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低MDA含量。GSHPx則是機(jī)體內(nèi)重要的分解過(guò)氧化物的含硒酶。GSHPx的酶活力可以作為衡量機(jī)體硒抗氧化的能力[8]。在體內(nèi)，SOD將超氧自由基O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，GSHPx進(jìn)一步將

H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，并且通過(guò)減少過(guò)氧化物對(duì)SOD的損害增加SOD的活性。SOD和GSHPx兩者之間明顯存在著相互保護(hù)作用和協(xié)同抗氧化作用[10]。還有研究通過(guò)測(cè)定SOD活性，推測(cè)其改善學(xué)習(xí)記憶作用可能與其提高體內(nèi)SOD活性有關(guān)[11]，其活力間接反映機(jī)體保護(hù)細(xì)胞免受損傷的抗氧化能力。

研究中，通過(guò)皮下注射D半乳糖，在體內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子自由基O2-和H2O2，引起代謝紊亂，進(jìn)而提高體內(nèi)自由基水平及過(guò)氧化體內(nèi)組織制造和自然衰老類(lèi)似的亞急性衰老模型[12]。同時(shí)，以此為模型，研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對(duì)小鼠的抗氧化作用。通過(guò)觀察小鼠外觀、血清學(xué)試驗(yàn)和行為學(xué)測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)造模成功。在小鼠行為學(xué)測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)富鋅富硒綠茶中劑量組的抗氧化作用最佳，提高小鼠的學(xué)習(xí)能力，延緩小鼠的衰老。

該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，富鋅富硒綠茶可明顯提高D半乳糖所致衰老小鼠肝臟組織中SOD、GSHPx mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。富鋅富硒綠茶可通過(guò)改變SOD、GSHPx的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，導(dǎo)致小鼠肝臟和血清中SOD、GSHPx含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，減慢細(xì)胞衰老的速度，達(dá)到改善衰老的作用。抗氧化生化指標(biāo)與水迷宮空間記憶能力試驗(yàn)中定向航行和空間探索試驗(yàn)結(jié)果相一致。另外，研究表明，中濃度富鋅富硒綠茶劑量抗氧化效果更佳，原因還有待進(jìn)一步研究。總之，貴州鳳岡富鋅富硒綠茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行為學(xué)特征，延緩衰老的進(jìn)程。

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