雜種楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因（XET）的生物信息學分析

趙慧 王遂 劉笑平 林永紅 王松波 宋雙林 李開隆

摘要 ?[目的]通過生物信息學方法對雜種楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因的DNA序列、蛋白質序列進行分析預測，為進一步研究奠定基礎。[方法] 以XET基因及其氨基酸序列為研究對象，利用多種網絡數據庫及生物信息學軟件對其進行分析預測。[結果]該基因編碼290個氨基酸殘基，相對分子質量33 672.0 D，理論等電點（pI）7.04;該酶可能存在3個卷曲結構部位、1個信號肽剪切位點和1個跨膜區，是典型的分泌蛋白;三級結構同源建模預測結果較好，二級結構預測中的螺旋、卷曲和折疊均可見。相似性比對和進化分析顯示其與葡萄等的序列相似度較高;而蛋白質三級結構的預測則發現，該酶與幾種桿菌的蛋白較接近。[結論]XET基因可能在很多生物中具有較高的保守性。

關鍵詞 楊樹;木葡聚糖內糖基轉移酶;生物信息學

中圖分類號 S792.11 文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12132-05

Bioinformatics Analysis of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa Xyloglucan Endotransglycosylase （XET） Gene

ZHAO Hui1， WANG Sui1， LIU Xiaoping2， LI Kailong1* et al ?（1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Jilin Linjiang Forestry Bureau， Linjiang， Jilin 134600 ）

Abstract ?[Objective] Analyze and predict the structure and feature of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa xyloglucan endotransglycosylase （XET） gene/protein sequence through bioinformatics method， and pave the way for the downstream experiments. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict XET gene and its corresponding protein. [Result] XET gene encodes 290 aa; protein molecular weight is 33 672.0 D， theoretical isoelectric point is 7.04; XET contains 3 coiled coils， 1 signal peptide and 1 transmembrane domain indicating that it is a typical secretory protein; prediction of secondary structure and homologous modeling of tertiary structure both returned rational results. [Conclusion] It is possible that XET gene possesses high conservation in different species.

Key words ?Populus alba × Populus tremula var. glandulosa; Xyloglucan endotransglycosylase; Bioinformatics

木葡聚糖內轉糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）是一類細胞壁松弛酶，屬于糖苷水解酶家族，在細胞伸長過程中扮演重要角色[1]。研究表明，在細胞快速伸長期伴有XET基因的表達，且XET的活性與細胞、組織的伸長呈正相關。XET促進細胞伸長是通過改變細胞壁網絡結構引起的細胞壁松弛來實現的，在該過程中木葡聚糖既是供體又是受體。首先，XET內分解木葡聚糖多聚體，使纖維素纖維絲分離，改變木葡聚糖/微纖維絲網絡結構，導致細胞壁松弛和細胞擴展;隨后XET將新形成的還原末端連接到其他含非還原末端的木葡聚糖多聚體上，使細胞壁恢復其穩定結構[2]。近來的研究還發現，XET在次生壁沉積的早期階段起作用，可能加強了初生和次生壁之間銜接[3]。因此，XET基因在細胞壁生物工程、植物生長、細胞壁結構及其物理特性改善等領域都有重要意義[4-5]。筆者通過較為全面的生物信息學分析方法對雜種楊樹（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）XET基因的DNA序列、RNA序列和蛋白質序列進行了分析，并對其蛋白質的結構與功能進行了預測，以期為進一步研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 所用材料楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因（XET）的NCBI登錄號為JX431932。

1.2 方法

使用NCBI中的Nucleotide數據庫獲取核酸序列相關信息。蛋白質理化性質預測使用ProtParam，酶切特性的預測使用DNAstar和BioEdit，親疏水性分析使用ProtScale軟件，信號肽預測使用SignalP4.1在線軟件包，磷酸化和糖基化位點的預測使用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1。蛋白質二級結構的預測分別使用PredictProtein和PSIPRED v3.0 2種預測工具。三級結構的預測則使用SwissModel Workspace同源建模網絡綜合服務器。利用NCBI數據庫Blast功能進行序列相似性查詢，進而通過ClustalX、DNAMAN和MEGA5.05進行多序列比對并構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶一級結構分析

2.1.1 核酸序列分析。

利用該基因的登錄號，在Nucleotide數據庫中檢索并得到該基因的相關信息，結果顯示該基因的完整轉錄序列總長1 141 bp，5UTR長146 bp，3UTR長122 bp，其CDS起始于ATG，終止于TAA，共873 bp，編碼290個氨基酸殘基。氨基酸序列見圖1。

圖1 氨基酸序列

2.1.2 氨基酸序列及蛋白質特性分析。

通過ProtParam軟件，在線檢測楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶的蛋白質序列理化參數，得出XET氨基酸數目為290個，相對分子質量33 672.0 D，理論等電點（pI）7.04。在整個氨基酸序列中，天門冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phe）含量最高，均為22個氨基酸，占總數的7.6%;而半胱氨酸（Cys） 含量最低，僅5個，占總數的1.7%。分子式為C1536H2262N402O431S13，脂肪系數（疏水值）為62.90，總平均親水性（GRAVY）為-0.450。

2.1.3 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶酶切特性預測。

首先利用BioEdit分析該基因的限制性位點，進而找到不能切割該蛋白的酶（圖2）。然后利用DNAstar軟件包中的Protean對該蛋白進行模擬酶切預測，結果見圖3。

圖2 不能切割該序列的限制性內切酶

圖3 蛋白酶酶切位點

2.1.4 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶親疏水性分析。

利用ProtScale軟件來繪制楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶親疏水性列譜，以預測其折疊情況。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法進行預測。結果發現，該蛋白質僅存在1個高分值峰（分值>1.5），分布在10～20等域;而3個低分值（分值<0）的峰分別位于100～110、130～140、240～250氨基酸位點附近（圖4），預測該3個位置為蛋白質的卷曲結構部位。

2.1.5 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶信號肽和亞細胞定位預測。

利用SignalP4.1在線軟件包對該蛋白質進行信號肽等的預測。物種選擇真核生物，其余使用默認參數進行預測。結果表明，其中C值最高為0.667，出現在第20個氨基酸T上，Y值最高為0.801，同樣出現在第20個氨基酸T上（圖5），基于Ymax判定，楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶具有信號肽，，其最可能的剪切位點位于第19和第20位之間，是一個典型的分泌蛋白。

圖4 ProtScale親疏水性分析預測結果

圖5 SignalP信號肽預測結果

2.1.6 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶氧糖基化位點預測。

蛋白質的糖基化是指在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質，和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化是對蛋白的重要的修飾作用，有調節蛋白質功能作用。利用在線預測軟件NetOGlyc3.1對楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶氧糖基化位點進行預測。結果顯示，該酶沒有氧糖基化位點。

2.1.7 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶激酶磷酸化修飾位點預測。

蛋白質磷酸化是指由蛋白質激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、絡氨酸）上的過程，是生物體內一種普通的調節方式，在細胞信號轉導的過程中起重要作用。利用NetPhos2.0進行在線的磷酸化位點預測。結果表明，楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶可能存在7個絲氨酸（Ser）、0個蘇氨酸（Thr）和5個絡氨酸（Tyr）的磷酸基化位點（圖6）。

圖6 NetPhos磷酸化位點預測結果

安徽農業科學 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2014年

圖7 PSIPRED預測蛋白質二級結構結果

2.2 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶二級結構預測

使用PredictProtein預測該蛋白質的二級結構，使用默認參數進行預測。結果顯示，該蛋白是一個alphabeta混合型蛋白，其中螺旋（H）占8.62%，折疊（E）占34.14%，環（L）占57.24%。對其二硫鍵的預測結果顯示該蛋白沒有完整的二硫鍵。此外，對蛋白質功能位點的預測結果顯示該蛋白質含有氮糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位點。

此外，通過PSIPRED平行進行蛋白質二級結構預測。使用PSIPRED v3.0，通過PSIBLAST搜索同源序列進而預測二級結構。結果與PredictProtein預測較相似（圖7）。

2.3 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶三級結構預測

使用SwissModel Workspace同源建模網絡綜合服務器對蛋白質三級結構進行預測，使用自動方式（Automated Mode），得出蛋白質三級結構模型見圖8。對構建好的模型進行全局和局部的評估。全局法中QMEANscore4的得分為0.68，模型質量較好。而局部法則顯示預測模型的健康度較好。而其序列相似性的比對結果顯示其與1umz_1（桿菌）極為相似。

2.4 楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶與其他物種的相似性比對以及進化分析

2.4.1 核酸序列的Blast比對。

使用BlastP對其進行氨基酸相似性比對，發現除楊樹相關雜交種外，楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶氨基酸序列還與美味獼猴桃（Actinidia deliciosa，AAC09388.1）、垂枝樺（Betula pendula，ABB72441.1）、柿樹（Diospyros kaki，AEQ37176.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002274520.1）、沙梨（Pyrus pyrifolia，CA02823.1）、蘋果（Malus ?domestica，N07897.1）、旱金蓮Tropaeolum majus，AAB39950.1）等的氨基酸序列相似性較高，相似度依次為93%、92%、91%、94%、90%、90%和85%。

2.4.2 多序列比對。

應用ClustalX和DNAMAN將楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因所編碼的蛋白質與美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）、垂枝樺（Betula pendula）、柿樹（Diospyros kaki）、葡萄（Vitis vinifera）、沙梨（Pyrus pyrifolia）、蘋果（Malus ?domestica）、旱金蓮（Tropaeolum majus）等XET相關蛋白質的氨基酸序列進行進行多序列比對，發現XET相關基因同源性很高（圖9）。

圖8 蛋白質三級結構預測結果

2.4.3 基于進化距離的進化樹構建。

繼續使用MEGA5對上述8種生物的進化距離進行估計，其中差異估算方法使用pdistance，得到的結果見圖10。

進而使用MEGA5進行進化樹構建，使用NJ法，檢驗方法選擇“Bootstrap method”，抽樣次數為500。進化樹見圖11。通過對XET比對發現楊樹與葡萄等的親緣關系較近。

3 討論

通過生物信息學的方法對楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因的DNA序列、蛋白質序列進行了分析，并對蛋白質的結構與功能進行了預測。一級結構預測發現，該基因編碼290個氨基酸殘基，相對分子質量33 672.0 D，理論等電點（pI）7.04;蛋白質的結構分析顯示該酶存在3個卷曲結構部位，第19和第20位氨基酸間存在信號肽剪切位點，有12個磷酸化位點和1個氮糖基化位點，存在1個跨膜區，無二硫鍵，是一個典型的分泌蛋白。對整個XET基因家族進行分析，發現

圖9 不同物種木葡聚糖內糖基轉移酶多序列比對分析

圖10 兩兩序列間進化距離

圖11 Bootstrap檢驗過的一致樹

其大都具有相對保守的糖基化位點，其催化活性位點為

EIDFE[2]，而在楊樹木葡聚糖內糖基轉移酶基因亦發現了該片

段，位于110個氨基酸附近，從側面驗證了預測的準確性;三級結構同源建模預測結果較好，二級結構預測中的螺旋、卷曲和折

疊均可見。對該酶的DNA序列進行Blast，進而構建進化樹，發現其與葡萄等的序列相似度較高;而蛋白質三級結構的預測則發現，該酶與幾種桿菌的蛋白較接近，表明其結構可能在很多生物中具有保守性。

參考文獻

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JOHANSSON P，BRUMER H，BAUMANN M J，et al.Crystal structures of a poplar xyloglucan endotransglycosylase reveal details of transglycosylation acceptor binding[J]. The Plant Cell Online，2004， 16（4）： 874-886.

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