無患子粗提液抑菌殺菌作用的研究

朱朝陽 胡仁火 孔瓊 任婷婷 周彩文

摘要 [目的]探究無患子粗提物的抑菌殺菌效果。[方法]酶解法提取無患子果皮中的皂苷，并測其皂苷含量。將皂苷粗提液稀釋成3種濃度，用這3種濃度的粗提液分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和酵母菌進(jìn)行抑菌試驗，測定抑菌率;用無患子皂苷粗提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌進(jìn)行殺菌試驗，測定殺菌率。[結(jié)果]隨著無患子粗提液皂苷濃度的提高，其對金黃色葡萄球菌的抑菌率保持25%不變，對其他4種菌的抑菌率均有不同程度的提高，其中對酵母菌的抑菌率高達(dá)68.4%;111.9 mg/ml的無患子皂苷粗提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌的殺菌率隨著殺菌時間的延長均有不同程度的提高，其中對酵母菌的殺菌率最高，30 min內(nèi)達(dá)100%。

關(guān)鍵詞 無患子; 皂苷粗提液; 抑菌; 殺菌

中圖分類號 S567 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12081-02

Study on Bacteriostasis Activity and Disinfection Function of the Sapindus mukurossi Gaertn Crude Extract

ZHU Chaoyang， HU Renhuo*， KONG Qiong et al

（School of Nuclear Technology and Chemistry & Life Science， Hubei University of Science and Technology， Xianning， Hubei 437100）

Abstract [Objective] To study bacteriostasic activity and disinfection function of the Sapindus mukurossi Gaertn crude extract. [Method] Enzymatic hydrolysis was used to extract the saponin from the pericarp of the Sapindus mukurossi Gaertn， and then saponin content was tested. The saponin crude extract was diluted into three kinds of concentration which would be tested on Escherichia coli， Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， S.albus， Saccharomyces cerevisiae， then the inhibitory rate was determined; sterilization experiment was conducted by using Sapindus mukurossi Gaertns saponin extract on Escherichia coli， Bacillus subtilis， Saccharomyces cerevisiae. The sterilization rate was measured. [Result] With the saponin concentration increased， the inhibitory rate on Staphylococcus aureus remained 25% unchanged， while inhibition rate on the other four kinds of bacteria increased in different degree， including inhibition rate on Saccharomyces cerevisiae was as high as 68.4; 111.9 mg/ml of Sapindus mukurossi Gaertn saponin crude extracts sterilization rate on Escherichia coli， Bacillus bacillus， Saccharomyces cerevisiae have different degrees of improvement with the sterilization time prolong， among them the highest sterilition rate of Saccharomyces cerevisiae reached 100% in 30 min .

Key words Sapindus mukurossi Gaertn; Saponin crude extract; Bacteriostasis activity; Disinfection function

無患子是無患子科無患子屬的一種落葉喬木，學(xué)名無患子（Sapindus Mukurossi Gaertn），俗稱油患子、洗手果等。主產(chǎn)于東南亞各國，我國的長江流域、南部各省及海南島均有栽培。無患子的果皮、種子、根、皮、葉均有藥用價值。目前對無患子的研究主要集中在化學(xué)成分的分析及有效成分皂苷的提取與分離[1]，也有關(guān)于無患子粗提物殺蟲活性的報道[2]。無患子對真菌的作用偶有報道[3]，無患子皂苷抑菌殺菌活性研究鮮見報道。該研究選取了5種常見菌作為供試菌種進(jìn)行抑菌殺菌試驗，研究無患子皂苷的抑菌殺菌作用，以期為植物源殺菌劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 無患子果。在湖北科技學(xué)院校園內(nèi)采摘，烘干去核備用。

1.1.2 供試菌種。大腸桿菌（Escherichia coli）;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）;釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌種由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程室提供。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 試驗儀器。DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯儀器有限公司），SWCJID超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），IU1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），KA0018465移液器（DragonLAB），84Ⅱ磁力攪拌器（山東鄄城永興儀器廠），ASW20501U實驗室超純水系統(tǒng)（艾科浦），JA5003電子天平，SHH.Wo1.600電熱恒溫水槽。

1.2.2 試驗試劑。5%NaOH溶液，5%HCl溶液，pH試紙，纖維素酶（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），冰醋酸（分析純，天津博迪化工有限公司），高氯酸（分析純，天津市鑫源化工有限公司），甲醇（科密歐，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），香草醛（Vanillin，上海源葉生物科技有限公司），齊墩果酸（上海源葉生物科技有限公司）。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 無患子皂苷粗提液制備及皂苷濃度測定。

1.3.1.1 無患子皂苷粗提液制備。在70 ℃條件下干燥無患子果，去核，粉粹果皮。稱取200 g粉末，加10倍水、0.015%纖維素酶，在pH=4、50 ℃條件下酶解2 h，期間每隔20 min攪拌一次。酶解液減壓抽濾，90 ℃加熱2 min，再抽濾得濾液備用[4]。

1.3.1.2 皂苷濃度測定。配制0.000 2 g/ml齊墩果酸-甲醇對照液10 ml，備用;配制0.05 g/ml香草醛-冰醋酸液10 ml，備用。分別用微量加樣器取對照液20、50、80、130、150 μl，先后依次加入5%香草醛-冰醋酸液0.4 ml、高氯酸1.4 ml，充分搖勻后于70 ℃水浴加熱20 min，取出后立即冰水冷卻2 min，加入10 ml冰醋酸，在478 nm處測吸光度，以不加對照液為空白組[5]。分析得出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，取80 μl無患子粗提液按上述過程操作測得其吸光度，再計算無患子粗提液皂苷濃度[6]。

1.3.2 菌懸液的配制。將上述5種菌，分別用接種環(huán)挑取少許菌體于裝有無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻，制成菌懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌生理鹽水稀釋至106 cfu/ml，備用[7]。

1.3.3 無患子皂苷粗提物的抑菌試驗。將無患子皂苷粗提物稀釋成3個濃度梯度，即C1=111.9 mg/ml、C2=74.6 mg/ml、C3=37.3 mg/ml，以無菌水為空白對照，共4個處理。用濾紙片擴(kuò)散法[7]進(jìn)行抑菌試驗，即無菌條件下用微量加樣器吸取100 μl菌液加入平板固體培養(yǎng)基中，用涂布器涂布均勻，一共涂布4個平板（平板直徑9 cm），1號平板貼3片浸有C3皂苷提取液的無菌濾紙片，2號平板貼3片浸有C2皂苷提取液的無菌濾紙片，3號平板貼3片浸有C1皂苷提取液的無菌濾紙片，4號平板貼3片浸有無菌水的無菌濾紙片作對照（濾紙片直徑均為6 mm）;5種菌的操作與上述相同。將涂布好并貼有濾紙片的細(xì)菌平板在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，將涂布好并貼有濾紙片的酵母菌平板在28 ℃條件下倒置培養(yǎng)48 h。測抑菌圈大小，計算抑菌率。抑菌率 =（試驗抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑）/試驗抑菌圈直徑×100%。

1.3.4 無患子皂苷粗提物的殺菌試驗。

用C1的無患子皂苷提取液對酵母菌、枯草桿菌、大腸桿菌3種菌進(jìn)行殺菌試驗。無菌條件下，在1號和2號的潔凈離心管中加1 ml無患子皂苷提取液、3號加1 ml無菌水。用移液器取20 μl攪拌均勻的大腸桿菌菌液滴在1號離心管中，搖勻，30 min后取20 μl液體均勻涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上;用移液器吸取20 μl大腸桿菌菌液滴在2號離心管中，搖勻，15 min

后取20 μl液體均勻涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上;用

移液器吸取20 μl菌液滴在3號離心管中，搖勻后取20 μl均勻涂布在培養(yǎng)基上。每一時間梯度3個重復(fù)。同樣，枯草桿菌菌、酵母菌均按上述操作試驗，酵母菌涂布在馬鈴薯培養(yǎng)基上。大腸桿菌、枯草桿菌在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，酵母菌在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。統(tǒng)計培養(yǎng)好的平板菌落數(shù)，計算殺菌率。

殺菌率=（對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 無患子皂苷粗提液濃度測定結(jié)果 由圖1可知，皂苷溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為 y=0.003 1x+0.010 6（R2=0.968 2），測得無患子皂苷粗提物的吸光度OD=3.48，無患子皂苷粗體液濃度C=111.9 mg/ml。

圖1 無患子皂苷粗提液濃度測定

2.2 無患子皂苷粗提液對5種菌的抑制結(jié)果

從表1可知，皂苷提取液對5種試驗菌均有抑制作用，隨著皂苷濃度升高，除金黃色葡萄球菌外對其他4種菌的抑制作用均有不同程度的提高;皂苷粗提液對酵母菌的抑制效果最好，抑菌率可達(dá)68.4%，與對照組相比抑菌圈大小達(dá)到了極顯著水平，這與Tamura的研究結(jié)果[8]相似，皂苷粗提液對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱。不同的菌對皂苷的敏感程度存在顯著差異。

表1 無患子粗提液對五種菌的抑菌作用

皂苷粗提液

mg/ml

枯草芽孢桿菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

大腸桿菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

金黃色葡萄球菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

白色葡萄球菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

酵母菌抑菌圈∥mm抑菌率∥%

37.311.0b 45.510.4b42.38a258.6b 30.216.6bB63.9

74.614.0b 57.110.5b42.98a259.0b33.318.0bB66.7

111.914.2b57.711.0b45.58a2510.0b40.019.0bB68.4

06.0a06.0a0 6a06.0a0 6.0aA0

注：抑菌圈大小均為3個數(shù)據(jù)的平均值。表中小字母代表0.05的顯著水平，大字母代表0.01的顯著水平。

2.3 無患子皂苷粗提液對枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌的殺菌作用

由表2可知，殺菌時間在15 min時，111.9 mg/ml皂苷粗提液對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌的殺菌率分別為35.60%、46.72%、98.59%;30 min時，皂苷粗提液對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌的殺菌率分別為46.56%、52.11%、100.00%。15 min和30 min處理結(jié)果與對照組結(jié)果存在極顯著差異，而15 min和30 min處理結(jié)果間無顯著差異;無患子皂苷對酵母菌的殺菌作用與對大腸桿菌和枯草桿菌的殺菌作用存在極顯著差異。無患子皂苷對酵母菌的殺菌作用強于對其他2種細(xì)菌的殺菌作用，其結(jié)果與抑菌試驗的一致。用111.9 mg/ml皂苷粗提液對白葡萄球菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺菌試驗，殺菌率均低于28%，故沒有列入表中。

表2 無患子粗提液對3種菌的殺菌作用

殺菌時間

min大腸桿菌殺

菌率∥%枯草桿菌殺

菌率∥% ?酵母菌殺

菌率∥%

1535.6046.7298.59

3046.5652.11100.00

對照000

3 ?結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明無患子皂苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球