玉米秸稈纖維素降解菌的分離及發酵條件優化

向殿軍　滿麗莉　張春鳳等

摘要[目的]研究玉米秸稈纖維素降解菌的分離與產酶條件。[方法]從富含腐爛玉米秸稈的土壤中分離篩選到1株能降解纖維素的真菌C01，經形態觀察和ITS序列分析，初步鑒定該菌種，并對該菌產酶條件進行優化。[結果]玉米秸稈纖維素降解真菌最佳接種種齡5 d，培養液初始pH為5，接種量12%；培養時間5 d的優化條件下，酶活力達1.76 IU/ml。該菌株對玉米秸稈降解效果較好，優化條件下，7 d降解率達66.8%。[結論]該研究可為提高玉米秸稈的利用率提供優質的菌種資源。

關鍵詞玉米秸稈；纖維素降解；分離；產酶條件

中圖分類號S181.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01159-03

基金項目牡丹江市科學技術計劃項目（玉米秸稈纖維素降解菌的選育及應用研究，G2013n0012）的階段性研究成果。

作者簡介向殿軍（1978-），男，黑龍江望奎人，講師，博士，從事農業基礎研究。*通訊作者，講師，博士，從事食品基礎研究。

纖維素是構成植物細胞壁的主要成分，占植物干重的1/3～1/2，全球一年間由光合作用生產的纖維素約1.5×109 t[1-2]。我國是一個農業大國，每年的秸稈產量約7.0億t，其中玉米秸稈占2.2億t[3]。纖維素中由于存在許多高能的氫鍵，因此其水解、利用均很困難，89%的秸稈以堆積、荒燒等形式直接傾入環境，造成極大的污染和浪費。秸稈還田可補充土壤有機質，維持土地利用的物質平衡，利于農業可持續發展，是降解秸稈的一種良好途徑。相對于間接還田方式，玉米秸稈原位還田可減輕勞動強度，節省成本，已經在農區廣為推廣應用。然而，我國北方地區玉米收獲、秸稈還田是在深秋時節，由于氣候干燥、溫度偏低，原位還田的玉米秸稈自然腐解速度緩慢，給農業生產帶來許多不利影響，導致秸稈還田應用阻力較大，應用面積小，配施適當的秸稈降解菌劑是解決該問題的有效方法[4-5]。但目前纖維素酶生產菌株的酶活力不高，因此篩選高活力的纖維素酶生產菌株是開展秸稈原位還田和堆漚還田的一個關鍵前提。該研究從常年堆積玉米秸稈的土壤中篩選到1株高纖維素酶活的纖維素降解真菌，通過分子生物學手段對其進行了鑒定，并對其產酶條件進行了初步研究， 以期為提高玉米秸稈的利用率提供優質的菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。土壤樣品采集自牡丹江市郊區玉米秸稈堆積處。玉米秸稈為成熟玉米秸稈地上部分，曬干、粉碎過80目篩備用。

1.1.2培養基。玉米秸稈篩選培養基：2%玉米秸稈粉，0.3% NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%瓊脂，自然pH。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養基：1%CMC-Na，0.3%NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%瓊脂，自然pH。種子培養基：20%馬鈴薯，2%蔗糖，自然 pH，固體培養基加入2%瓊脂。液體發酵產酶培養基：0.75%玉米秸稈粉，0.75%麩皮，0.5%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨。

1.2試驗方法

1.2.1 纖維素分解單菌株的篩選。將玉米秸稈堆腐樣品按適當梯度稀釋后接種至玉米秸稈篩選培養基上，30 ℃培養3 d進行增殖，挑取單菌落經3次平板劃線分離培養獲得純菌落，點接種于CMC-Na平板上，用1 mg/L剛果紅溶液染色1 h，再用1 mol/L 的NaCl溶液洗脫1 h后，測水解圈直徑。根據D值（D=水解圈直徑/天數）的大小進行初篩。將初篩的菌株接種于種子培養基中，30 ℃，180 r/min震蕩培養5 d，然后接種到液體發酵產酶培養基中，30 ℃，180 r/min震蕩培養5 d，測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活力，選取酶活最高的菌株試管斜面保存備用，作為進一步研究的對象。

1.2.2 酶活測定。取發酵液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液即得粗酶液。按宋穎琦等[6]試驗方法進行CMC酶活力測定。

1.2.3菌株形態和ITS序列鑒定。將菌株接種到平板上，培養3 d，觀察菌落的特征。在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，染色后置于顯微鏡下觀察，參照《真菌鑒定手冊》對其進行形態分析與鑒定。采用CTAB 法提取菌株C01的總DNA[7]，設計ITSf（5′-CACGGCTCTACCTGATCGAGGTCAC-3′）和ITSr（5′-CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′）引物，利用PCR技術擴增其ITS片段，產物經TA克隆后測序。將獲得的片段進行Blast分析，確定與其親緣關系最近的種屬，并從數據庫獲得相關種屬的ITS序列，利用CLUSTAL X和MEGA4.1軟件，采用臨近法構建系統發育樹，并進行1000 bootstrap檢測。

1.2.4 產酶條件優化。在250 ml錐形瓶中進行液體發酵，依次改變種齡（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、培養基初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接種量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%）及發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）中的某一因素，并保持其他發酵條件不變，通過測定CMCase活性，研究各因素對產酶的影響。

1.2.5 不同秸稈發酵試驗。保持氮源和發酵條件不變，分別用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈作為碳源發酵7 d，研究菌株C01對其降解效果。

2 結果與分析

2.1菌株篩選通過剛果紅透明圈法初篩出 6株形態不同的纖維素降解真菌（圖1），分別命名為C01～C06，其中C01、C03水解圈生成速度較快，說明分解纖維素類物質的能力較強（表1）。在相同培養條件下，對所有初篩菌株進行纖維素酶活測定，其中菌株C01的CMC酶活為1.52 IU/ml，高于其他菌株，因此選定C01作為進一步研究對象（表1）。

2.2菌株鑒定菌株C01在CMC-Na培養基上的菌落形態呈圓形，邊緣平整有白色菌絲，表面粗糙，初期為白色，后期因分生孢子的產生而呈深綠色，布滿一層分生孢子粉（圖2）。在油鏡下可以看到，菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈橢圓形或球形，不對稱分支2～5個，排列緊密，呈兩輪生的掃帚狀，分生孢子呈圓形或橢圓形（圖3）。根據菌落形態觀察和鏡檢結果，參照《真菌鑒定手冊》，初步判斷菌株C01為青霉屬。

培養液初始pH也是影響羧甲基纖維素酶活的一個主要因素。當培養液初始pH為5～6時，菌株C01的酶活較大（表2），而后隨著pH的升高，酶活不斷下降，表明C01纖維素酶系偏酸性。

接種量對酶活性的影響比較小，由表2可知，隨著接種量的增加，酶活力增大，即菌株產酶能力增強，當接種量為12%時，酶活力最高，接種量超過12%后，酶活力變化不大，略有下降。

菌株C01的羧甲基纖維素酶活隨著發酵時間的延長，呈現先增后降的趨勢，在第5天時達到最大值（表2），隨后降低，可能菌體出現老化，產生的蛋白酶影響了羧甲基纖維素酶活，此外，反應過程中產生的纖維素二糖、葡萄糖也能對酶解反應形成反饋抑制。

2.4菌株C01對各種秸稈的降解率 對各種秸稈的降解效果研究表明，菌株C01對秸稈纖維素具有高效降解作用（表3）。其中對玉米秸稈的降解轉化率最高，降解率達到66.8%，分別為水稻秸稈和小麥秸稈降解率的1.21和1.25倍，這可能是由于篩選環境為玉米秸稈堆積土壤的原因。

3結論

從常年堆積玉米秸稈的土壤中篩選到6株產纖維素酶的真菌，通過測定羧甲基纖維素酶活得到纖維素酶活最高的菌株C01。對該菌株進行形態學和ITS分子生物學鑒定，確定其為青霉屬。對C01產酶條件進行了初步研究，確定該菌株最佳產酶條件為：接種種齡5 d，培養液初始pH 5，接種量12%，培養時間5 d，在此條件下，其酶活力達1.76 IU/ml。該研究篩選到的C01菌株酶活較高，有一定的應用價值，可為下一步玉米秸稈降解的實際應用奠定基礎。

參考文獻

[1] 孫海彥， 趙平娟， 黎絹華，等. 纖維素酶高產菌株的篩選及鑒定[J]. 安徽農業科學， 2011， 39（36）： 22206-22208.

[2] 宋穎琦， 楊謙.纖維素降解菌的篩選及其降解特性的研究[J]. 哈爾濱工業大學學報， 2002， 34（2）：197-199.

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[6] 宋穎琦， 劉睿倩， 楊謙， 等. 纖維素降解菌的篩選及其降解特性的研究[J]. 哈爾濱工業大學學報， 2002， 34（2）： 197-200.