秋水仙堿誘導山楊異源多倍體

李靜　李春明　卓泳杉　楊玉煥

摘要[目的]利用綜合倍性育種和雜交優勢的多倍體育種培育山楊優良新品種。[方法]以中國山楊及其雜交品種中美山楊為母本，山楊和新疆楊為父本，進行樹上雜交與切枝水培雜交，對授粉后的雌花序施加秋水仙堿進行多倍體誘導，利用流式細胞術檢測植株倍性。[結果]切枝水培雜交，授粉48 h后，以濃度0.3%秋水仙堿持續處理24 h，誘導三倍體效果最佳；授粉96 h后，以濃度0.3%秋水仙堿持續處理24 h，誘導四倍體效果最佳。另外樹上雜交，授粉96 h后，以濃度0.1%秋水仙堿持續處理48 h，誘導三倍體效果最佳；授粉120 h后，以濃度0.1%秋水仙堿持續處理48 h，誘導四倍體效果最佳。[結論]對山楊、中美山楊授粉后施加秋水仙堿處理，成功獲得了三倍體與四倍體，結果表明利用秋水仙堿溶液誘導山楊多倍體行之有效。

關鍵詞山楊；多倍體；秋水仙堿

中圖分類號S792.11文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01098-03

基金項目黑龍江省森工總局基礎研究項目（sgzjY2013003、sgzjY2010012）；黑龍江省財政廳自擬項目（201204，201303）。

作者簡介李靜（1986-），女，山東臨邑人，碩士研究生，研究方向：楊樹倍性育種。*通訊作者，副教授，從事細胞活性物質利用研究。

山楊（Populus davidiana Dode.）屬白楊派，又稱中國山楊，在我國廣泛分布，抗寒、耐旱，是撂荒地、采伐跡地和火燒跡地森林更新的先鋒樹種。山楊木材結構均勻、質輕而軟、顏色淡白，纖維長、寬、長寬比和纖維素含量等均高于大青楊、香楊和小黑楊等，不用填充其他原料即可用于造紙[1]。山楊這些特性在短周期紙漿材等森林工業用材生產中具有明顯優勢[2-4]。近年來，隨著經濟的快速發展，我國對紙張的需求驟增，同時對紙張品質的要求也在不斷提高。山楊作為優質紙漿原材，其可利用的天然林日漸減少，此時就需要營造大量人工林來填補天然林供應不足的空缺。

國內外有關倍性育種的實踐證明，多倍體育種由于染色體倍數性增加，常常帶來一些形態和生理上的變化，其在提高種子生長速度、增進遺傳品質以及提高目的代謝物含量等方面具有優勢，可以通過一輪次育種過程實現多目標性狀遺傳改良。楊樹多倍體在材積生長量、木材品質以及抗性方面具有很大優勢[5-8]。目前關于山楊的遺傳改良主要集中于選優、雜交育種等方面，迄今未見有關山楊多倍體誘導成功的研究報道。該研究主要以山楊及其雜種為材料，對授粉后施加秋水仙堿溶液誘導山楊多倍體的技術條件進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料以山楊以及雜交品種中美山楊為母本，山楊和新疆楊為父本。其中山楊取自黑龍江省林口縣青山林場山楊基因保存林，新疆楊取自阿克蘇地區，中美山楊取自黑龍江省林業科學院院內保存林，是引進生長優異的美洲山楊花粉與優良種源的中國山楊進行地理遠源雜交選育出的優良品種。

于2月上旬，收集楊樹枝條，選擇直徑為1～2 cm，無病蟲害、帶有花芽的、健壯的枝條，將雌花枝剪成1.5～2.0 m長，雄花枝剪成1.0 m左右，用塑料薄膜將上述花枝包裹后帶回哈爾濱，低溫保存備用[9]。

1.2研究方法

1.2.1 雜交育種。雜交育種分為樹上雜交與切枝水培雜交。樹上雜交利用的是位于黑龍江省林業科學院院內的中美山楊保存林。切枝水培雜交以山楊為母本。首先將選擇好的雄花枝進行室內切枝水培，收集花粉，干燥，貯藏于4 ℃冰箱備用。觀察雌花發育情況，到可授期時分別用上述花粉授粉[10-12]。

1.2.2 利用秋水仙堿誘導加倍。授粉后施加秋水仙堿處理誘導加倍，自授粉48 h后，對雌花序進行秋水仙堿誘導處理，處理方式為瓶浸法，秋水仙堿溶液濃度為0.1%、0.3%、0.5%，切枝雜交為處理持續時間24、36、48 h，樹上雜交為處理持續時間24、48、72 h。繼續培養至蒴果開裂、吐絮時，套袋、收取種子，點播于經高溫滅菌的土中，適時移入營養缽，待其繼續長至25 cm高時移栽大田。

1.2.3 流式細胞術檢測子代倍性。利用流式細胞儀檢測山楊雜種子代倍性，具體方法如下，取約2 cm×2 cm生長正常的展開葉片置于培養皿里，加入2 ml 4 ℃預處理的提取緩沖液[1 000 ml為例，10 mmol/L MgSO4·7H2O 2.46 g，50 mmol/L KCl 3.727 5 g，5 mmol/L HEPES 1.191 5 g，1%（W/V） PVP-40 10 g，0.25%（V/V） Triton X-100 2.5 ml，pH=8.0]，用鋒利的刀片快速將其切碎；葉片組織搗碎液用30 μm濾網過濾至上樣管中，收集的濾液中加入1 ml Staining solution（Partec）染液，充分混勻后染色5 min；采用Partec CyFlow-PA型流式細胞儀對樣品進行染色體倍性檢測。

2 結果與分析

以山楊、中美山楊為母本，山楊、新疆楊為父本進行雜交，切枝水培雜交與樹上雜交授粉后施加秋水仙堿處理，都獲得了三倍體與四倍體。

2.1授粉后施加秋水仙堿處理誘導多倍體

2.1.1 切枝水培雜交。以優良種源山楊為母本，新疆楊為父本，授粉后，利用不同濃度秋水仙堿浸泡山楊雌花序，誘導山楊雜種三倍體或四倍體。倍性檢測結果表明，有2個處理組合獲得三倍體，共4株，有1個處理組合獲得四倍體2株。其中，授粉48 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續24 h，保留2年生雜種子代苗6株，其中三倍體2株，誘導比例達33.3%（表1），另外，授粉72 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續24 h，保留2年生雜種子代苗42株，其中三倍體1株，誘導比例為2.3%。授粉96 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續24 h，保留2年生雜種子代苗11株，其中四倍體2株，誘導比例為18.2%。因此，授粉48 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續24 h，誘導山楊產生3倍體效果最好，授粉96 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續24 h，誘導山楊產生四倍體效果最好。

2.1.2 樹上雜交。以中美山楊為母本，優良種源山楊為父本，授粉后，利用不同濃度秋水仙堿浸泡山楊雌花序，誘導山楊雜種三倍體或四倍體。倍性檢測結果表明，有1個處理組合獲得三倍體2株，有1個處理組合獲得四倍體1株。授粉96 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續48 h，保留2年生雜種子代苗75株，其中三倍體2株，誘導比例達2.7%（表2），另外，授粉120 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續48 h，保留2年生雜種子代苗16株，其中四倍體1株，誘導比例為6.3%。因此，授粉96 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續48 h，誘導山楊產生三倍體效果最好，授粉120 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續48 h，誘導山楊產生四倍體效果最好。

2.2流式細胞術鑒定植株倍性采用Partec CyFlow-PA型流式細胞儀對樣品進行染色體倍性檢測。測試樣品細胞核DNA的含量是以對照為標準的相對值（圖1）。

參考文獻

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