中國小家鼠細胞色素b基因序列分析

徐健　靖美東　黃玲

摘要[目的]研究中國小家鼠的細胞色素b基因序列與DNA分類系統。[方法]對來自陜西漢中、新疆烏魯木齊、云南昆明、湖北武漢和臺灣等18個地區的20只小家鼠個體進行基因組DNA提取，細胞色素b基因的PCR擴增和序列測定，并分析堿基組成，構建系統進化樹。[結果] 20只小家鼠基因組大小均在20 000 bp以上；小家鼠細胞色素b基因序列中A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%，個體間堿基組成幾乎無差別；漢中、烏魯木齊等長江以北的12個個體與M.m.musculus的系統發育關系為一支系，昆明、武漢、臺灣等8個長江以南的個體與M.m.castanues的系統發育關系較近。[結論]中國小家鼠以長江為界，可分為南北2大亞種，南方為M.m.castanues亞種，北方為M.m.musculus亞種。

關鍵詞中國小家鼠；細胞色素b；系統進化樹

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-00989-03

基金項目國家自然科學基金（31371252）。

作者簡介徐健（1987- ），女，山東德州人，碩士研究生，研究方向：細胞生物學。

小家鼠（Mus musculus）屬嚙齒目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠屬（Mus）動物，是全球性分布的人類共棲鼠類，體型較小，夜出活動，是生物進化、遺傳學及生態學研究的理想研究模型。小家鼠作為重要的模式生物，和人類關系密切。其生物地理模式與遺傳分化模式可能與人類的遷徙、貿易聯系、文化接觸和移民活動等直接相關[1]。對其起源和擴散的研究可探討人類的起源與擴散[2]。此外，小家鼠還對糖尿病、眼疾等人類疾病和免疫缺陷等醫學研究領域作出重要貢獻。雖然在過去30年里，研究者已經在小家鼠的生物地理學和古生物學方面做了大量研究[3]，在物種的起源進化和擴散歷史問題等方面積累了大量資料，但仍然有很多問題尚不清楚。

自1758年林奈命名小家鼠起，各地對于小家鼠亞種的報道也不斷增多，但其鑒別依據較為簡單粗略，因此有許多同物異名者。隨著分子生物學等技術引入小家鼠種群結構的研究，許多學者進一步對其分類系統提出了修改。目前流行的觀點認為，小家鼠包括3個亞種，分別是M.m.musculus，M.m.domesticus和M.m.castaneus[4]。其中，M.m.musculus分布在東歐和東北亞地區，M.m.domesticus分布在西歐、中東和北非地區，M.m.castaneus分布在東南亞和印度次大陸[3]。在過去的數百年里，M.m.domesticus已經借由人類活動擴散到了非洲、澳大利亞、南美、北美及許多海洋性島嶼。

我國疆域遼闊，地形地貌豐富，氣候狀況復雜，地理氣候環境的多樣性孕育了豐富的小家鼠遺傳資源。然而，一直以來針對中國小家鼠的系統地理學研究鮮有報道，有很多問題仍不清楚。其中，中國小家鼠的分類系統不明確。Ellerman和MorrisonScott記錄了至少5個亞種[5]。之后，Marshall根據地理分布和形態特征將中國小家鼠區分為3個主要的組群，而Tsuchiya等基于形態特征將其分成了6個亞種。Prager等進行了線粒體DNA序列分析[6]，認為中國內蒙古和北京2個地區的標本屬于M.m.musculus。然而，這些最初的基因研究只包含有限的樣本，所涉及的地理分布范圍不是很廣。因此，要想知道中國小家鼠的分類系統，就必須要加大采樣范圍進行更詳盡的研究。

線粒體細胞色素b基因能夠為揭示姐妹種或相近種的親緣關系提供充分的信息[7]，因此是研究脊椎動物分子系統發育關系的有效分子標記[8]。劉曉明、羅靜等曾分別對中國西部的絨鼠屬和姬鼠屬的細胞色素b基因進行過研究，進一步證明了該基因作為屬內水平分子系統發育的分子標記的有效性[9-10]。筆者采集了18個地區的小家鼠樣品進行試驗，測定20個個體的細胞色素b基因的全序列，并將其與GenBank中下載的M.m.musculus（EF108342）、M.m.castaneus（EF108345）和Rattus norvegicus（X14848）的片段進行比對分析，并構建系統進化樹，進一步探討中國小家鼠亞種的分類情況，以期為相關研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料陜西漢中、新疆烏魯木齊、云南昆明、湖北武漢和臺灣等18個采集地的20個小家鼠樣品（表1）。取新鮮的鼠尾組織于100%乙醇中帶至實驗室，-80 ℃保存備用。

1.2樣品的擴增與測序剪取保存的小家鼠尾部組織，約綠豆粒大小（2.00 g左右），采用Promega試劑盒方法提取其基因組DNA。采用3對引物（表2），對長度約為1.2 kb左右的細胞色素b基因片段進行擴增。用Takara公司生產的Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）進行PCR擴增。擴增結果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測濃度合適后由上海生工生物工程服務有限公司測序。

2結果與分析

2.1小家鼠基因組DNA提取結果將提取的小家鼠基因組DNA通過電泳檢測并通過UVP凝膠成像系統觀察，DNA大小均在20 000 bp以上，條帶整齊清晰，單一明亮，雖有少許降解，但不影響試驗進行。

2.2小家鼠基因組DNA PCR擴增結果取5 μl PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，并通過UVP凝膠成像系統觀察，條帶整齊清晰，單一明亮，其余保存于4 ℃條件下，留待測序。

2.3DNA序列的堿基組成用Mega 5.2對所測序列進行分析，結果表明，細胞色素b基因的A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%。除作為外群的大家鼠（Rattus norvegicus，X14848）的堿基含量有些不同外，其余個體間堿基組成幾乎無差別（表3）。

2.4系統進化樹圖1表明，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）為外群，20個中國小家鼠個體分成2個大的分支。其中，HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH 這12個小家鼠個體與M.m.musculus（EF108345）小家鼠的系統發育關系較近，共享1個分支，在該分支中，UQ與HF、MH與CY、SL與DT兩兩分別具有相同的支長。TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX和GZ這8個個體與M.m.castanues（EF108342）小家鼠的系統發育關系較近，共享1個分支，在該分支中，WH與PX、TW2與TW3、GX與GZ兩兩分別具有相同的支長。

小家鼠作為一種重要的模式動物，已經在生物學、醫學研究的各個領域得到了廣泛的應用，其本身存在的遺傳差異也引起了高度的重視[11]。

試驗采用試劑盒方法提取小家鼠新鮮冰凍材料的基因組DNA，提取效果較好，用特異引物對基因組DNA進行PCR擴增，結果很好，上海生工生物公司對PCR產物進行測序順利，結果很好，將測序得到的結果與GenBank中已有的小家鼠序列進行比較，結果表明，擴增和測序結果正確。

通過序列對比發現，20個中國小家鼠個體的細胞色素b基因長為1 144 bp，其堿基序列及含量相差很小，A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%；AT含量（60.8%）大于GC含量（39.2%），存在顯著的AT偏性，每個個體間堿基組成幾乎無差別。20個個體的1 144個堿基中，TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ這8個個體有18處堿基不同于HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH這12個個體；此外，還有極少數的幾個堿基序列不一致，其余均相同。

試驗所用的小家鼠分別來自長江以南，包括臺灣省在內的6個地區，以及長江以北的12個地區。其中，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）在發育樹中處于最外1個分支，與發育樹內其他2個分支關系較遠；發育樹中第2個分支包括M.m.castanues（EF108342）和長江以南6個地區的8個個體（TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ），說明這8個個體屬于M.m.castanues亞種；長江以北12個地區的12個個體（HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH）與M.m.musculus（EF108345）構成第3個分支，說明這12個個體屬于M.m.musculus亞種。UQ與HF、MH與CY、SL與DT以及WH與PX、TW2與TW3、GX與GZ兩兩分別具有相同的支長，說明其DNA序列相同，表明它們來自同一母系祖先。這些結果顯示，中國小家鼠基因來源較復雜，以長江為界，可分為南北2大亞種：南方為M.m.castanues亞種，北方為M.m.musculus亞種。但由于所用分子標記有限，要想得到更詳盡的數據，應進一步擴大采樣范圍與樣品數量，并使用更多的分析標記來進行分析。

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