氯氰菊酯對小鼠腎組織的氧化損傷

馬 萍,張忠杰,焦 銘,廖文莉,陳姣娥,楊 旭,武 陽*(.湖北科技學院基礎醫學院,湖北 咸寧43700；.華中師范大學生命科學學院環境生物醫學實驗室,湖北 武漢 430079)

氯氰菊酯對小鼠腎組織的氧化損傷

馬 萍1,2,張忠杰1,焦 銘1,廖文莉1,陳姣娥1,楊 旭2,武 陽1,2*(1.湖北科技學院基礎醫學院,湖北 咸寧437100；2.華中師范大學生命科學學院環境生物醫學實驗室,湖北 武漢 430079)

以昆明小鼠為受試動物,隨機分為6組,包括1個陰性對照組、3個氯氰菊酯染毒組、1個維生素E組和1個高劑量氯氰菊酯加維生素E組,染毒組按10,20,40mg/kg水平,維生素E的劑量為100mg/kg,灌胃染毒小鼠7d.以腎組織勻漿測定活性氧(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量;以腎組織細胞測定DNA-蛋白質交聯(DPC)系數.隨著氯氰菊酯染毒劑量的升高,腎組織的ROS、MDA、8-OHdG含量和DPC系數逐漸上升,GSH含量逐漸降低,各指標呈一定的劑量-效應關系.染毒劑量為20mg/kg時,MDA和8-OHdG含量差異有統計學意義(P< 0.05);染毒劑量為40mg/kg時, ROS(F=3.7044)、GSH(F=3.4908)、MDA(F=3.5851)、8-OHdG含量(F=11.7934)和DPC系數(F=6.9165)差異均有統計學意義(P< 0.05, P< 0.01).病理學觀察可見20,40mg/kg劑量組小鼠腎小球增生肥大,腎小管上皮細胞水腫,管腔變小.與高劑量染毒組相比較,高劑量染毒加維生素E組腎組織的ROS、MDA含量、8-OHdG含量和DPC系數均有下降,GSH含量上升(P< 0.05, P< 0.01).高劑量(≥20mg/kg)的氯氰菊酯能造成小鼠腎組織的氧化損傷,維生素E有抗氧化作用.

氯氰菊酯；維生素E；活性氧；還原型谷胱甘肽；丙二醛；8-羥基脫氧鳥苷；DNA-蛋白質交聯；氧化損傷

擬除蟲菊酯類農藥是繼有機磷、有機氯等農藥之后發展起來的一類新型的殺蟲劑,氯氰菊酯(cypermethrin, CP)是目前我國最常用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑,CP以其高效低毒的顯著特點廣泛應用于農業、衛生、畜牧等各類害蟲的防治.隨著CP的大量使用,長期低濃度接觸CP引發的人類健康問題日益受到人們的關注.對其毒性作用的研究表明,它對人和動物的神經系統、消化系統、血液系統、免疫系統和生殖系統都有不同程度損害[1-2].佟俊旺等[3]通過彗星實驗證明當CP的染毒濃度達到80mg/kg時,能夠導致小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷.李海峰等[4]和安麗等[5]分別以雄性家兔和雄性大鼠為試驗對象,表明CP可導致動物睪丸結構損傷,精液活力下降[4-5].安麗等[6]還發現CP可致使小鼠體液免疫功能下降,其機制可能與脂質過氧化相關.崔永[7]研究發現CP可導致生殖細胞DNA鏈斷裂,降低DNA甲基化水平,影響與生殖細胞發生和成熟有關基因的表達,影響動物的生殖和發育.邴欣等[8]發現CP可誘導雄性金魚分泌卵黃原蛋白,且可使雄魚生殖腺指數明顯降低.本課題組先前的研究表明較高劑量的高效氯氰菊酯亦可造成小鼠腎臟的氧化損傷[9],但關于維生素E(VE)對CP導致腎組織氧化損傷的拮抗作用至今未見報道.本研究通過測定不同濃度CP作用下小鼠腎組織的ROS、GSH、MDA和8-OHdG含量、DPC系數的變化以及觀察腎組織切片的生理病理變化,并同時加入VE保護,以探究CP對小鼠腎臟的氧化損傷及VE的抗氧化作用,以期為CP導致腎組織氧化損傷的發生機理及診治提供某些科學依據.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Power wave XS酶標儀(美國Bio-Tek儀器有限公司), FLx 800熒光酶標儀(美國Bio-Tek儀器有限公司), F-4500型熒光分光光度計(日本日立公司), 5415R低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司),RM2245切片機(德國LEICA公司), HH-42三用電熱恒溫水箱(長源實驗儀器廠,北京); DCFH-DA熒光染料(>99.9%,Sigma公司),蛋白酶K(Sigma公司),小鼠8-羥基脫氧鳥苷ELISA檢測試劑盒(濟南朋遠生物技術有限公司),還原型谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所),Hoechst33258熒光染料(Sigma公司),三羥基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl,分析純, Amresco分裝),5,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB,分析純,國藥集團化學試劑有限公司),硫代巴比妥酸(TBA,分析純,國藥集團化學試劑有限公司),VE (≥98%,上海楷洋生物技術有限公司).純度為95% CP原藥,由上海業聯聯合化工有限公司生產.

1.2 實驗動物

選用湖北省實驗動物研究中心提供的SPF級雄性昆明小鼠30只(合格證號:No. 42000600001226),體重為(30 ± 1.8) g,飼養1周后實驗,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2013-0071.實驗過程中,小鼠飼養于無菌籠內,保持溫度在20～25℃,籠內相對濕度為50%～70%,以商業鼠糧飼養小鼠,及時補充飲用水,并避免其接觸其他干擾致病源,小鼠可自由進食進水.

1.3 動物分組和染毒

30只昆明小鼠隨機分為5組,包括1個陰性對照組、3個CP染毒組和1個高劑量染毒加VE組,每組6只.陰性對照組用花生油;染毒組分為低、中、高劑量組,根據前期研究[10-11],確定CP染毒劑量分別為10,20,40mg/kg,以花生油稀釋成1,2,4mg/mL 3種濃度的使用液;VE的劑量為100mg/kg.稀釋液現用現配,使用時在旋渦混懸儀上充分混勻.均經口灌胃給予,灌胃量為10ml/kg,陰性對照組和染毒組每天1次,高劑量染毒加VE組上午給予染毒液,下午給VE,連續染毒7d,分別于實驗前稱小鼠體重.

1.4 腎組織切片的制備和觀察

染毒結束后用頸椎脫臼法處死小鼠,立即取腎組織,肝組織用4%的多聚甲醛固定,常規脫水,石蠟切片,HE染色,普通光學顯微鏡下觀察腎組織的病理組織學變化.

1.5 腎組織勻漿和細胞懸液的制備

將腎組織在冰冷的PBS(pH=7.5)中漂洗,濾紙拭干,分成兩部分,一部分腎組織加PBS制成10%勻漿液,低溫離心后取上清,用于ROS、GSH、MDA和8-OHdG的檢測.另一部分腎組織剪成糜狀,過濾后將細胞濾液離心去上清,再用 PBS重懸細胞,用于DPC系數的檢測.

1.6 實驗方法

1.6.1 ROS含量的測定 取上清液4μL,加入396μl PBS作100倍稀釋.取100μL稀釋液于酶標板中排列,并加入100μL熒光染料DCFA染色,避光反應5min,用熒光酶標儀檢測.

1.6.2 蛋白質含量和GSH含量的測定 蛋白質含量按照Folin酚法測定,GSH含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行.GSH含量(μmol/ gprot)=[(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準管濃度×樣本稀釋倍數÷待測勻漿蛋白濃度(gprot /L).

1.6.3 MDA含量的測定 取500μL上清液于試管中,并加入2mL 0.6%TBA,沸水浴15min.取上清1mL于EP管中,10000×g離心力離心5min.取上清100μL于酶標板中排列,用全波長酶標儀檢測,分別在450nm、532nm和600nm波長下測定吸光值(以加PBS的為參照),按照公式MDA濃度(μmol/gprot)=[6.45(A532-A600)-0.56A450]÷待測勻漿蛋白濃度(gprot/L),式中,A為吸光度.

1.6.4 8-OHdG含量的測定 8-OHdG含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行.以0,3,6,12, 24,48ng/mL等標準品濃度為橫坐標,450nm 處OD值為縱坐標,繪制標準曲線,根據標準曲線來確定樣品中8-OHdG的含量.

1.6.5 DPC系數的測定 采用KCl-SDS沉淀法進行檢測[12].向樣品中加入SDS,使之與 DPC及蛋白質結合,然后加入KCl溶液使DPC和蛋白質沉淀,而游離的DNA留在上清液中.將上清液轉移后,再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質,使DPC中的DNA游離出來,用熒光法測定此DNA的含量A(交聯DNA)以及原液中DNA的含量B(游離DNA),計算DPC系數η[η=A/(A+B)].

1.7 統計分析

實驗數據均采用χ±s表示.采用SPSS 12.0軟件進行統計分析,多組間均數比較使用單因素方差分析(ANOVA),然后使用LSD檢驗比較兩組間均數的差異性,統計檢驗水準α= 0.05.

2 結果

2.1 小鼠腎組織切片形態的變化

圖1 不同處理組腎組織切片(×400)Fig.1 Kidney slices of different groups (×400)

從腎組織切片圖1看到,空白對照組腎小球及腎小管結構正常;低劑量組(10mg/kg)小鼠腎臟的腎小管上皮細胞輕度水腫,管腔變小;中劑量組(20mg/kg)小鼠腎小球增生肥大,腎小管上皮細胞水腫明顯,管腔變窄;高劑量組(40mg/kg)小鼠的腎小球明顯增生肥大,可見球內毛細血管襻分葉;腎小管上皮細胞水腫,管腔變窄,甚至閉塞.結果表明,隨著染毒劑量的加大,小鼠腎細胞的病理損傷越嚴重.CP+VE組小鼠的腎小管上皮細胞水腫明顯,管腔變窄,病理損傷輕于高劑量組.

2.2 小鼠腎組織ROS含量的變化

不同處理組腎組織的ROS含量的變化見圖2.ROS含量是反映機體氧化應激水平的指標,可以看出,隨著染毒劑量的升高,ROS含量逐漸上升,呈一定的劑量-效應關系.與對照組比較,低、中劑量組(10,20mg/kg)差異無統計學意義,高低劑量組(40mg/kg)差異有統計學意義(P<0.05).以上結果表明,較高劑量的CP能造成ROS含量的上升.氯氰菊酯+VE組ROS含量低于CP高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05).

圖2 不同處理組小鼠腎臟ROS含量Fig.2 ROS content in mouse kidney of different groups

2.3 小鼠腎組織GSH含量的變化

圖3 不同處理組小鼠腎臟GSH含量Fig.3 GSH content in mouse kidney of different groups

GSH是GPχ(谷胱甘肽過氧化物酶)催化過氧化物還原的必需底物,故GSH含量也可反映機體抗氧化應激的水平,由圖3可見,隨著CP染毒劑量的升高,腎組織GSH含量逐漸下降,呈一定的劑量-效應關系.與對照組比較,低、中劑量組(10,20mg/kg)差異無統計學意義,高劑量組(40mg/kg)差異有統計學意義(P<0.05).以上結果表明,在較高劑量的CP作用下,小鼠肝的GSH含量下降明顯.CP+VE組GSH含量高于CP高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05).

2.4 小鼠腎組織MDA含量的變化

由圖4可見,與對照組比較,不同劑量的CP均能使小鼠腎MDA含量有不同程度的升高.低劑量組(10mg/kg)差異無統計學意義,中、高劑量組(20,40mg/kg)差異有統計學意義(P<0.05, P<0.01),這表明小鼠腎組織的脂膜已受到損傷. CP+VE組MDA含量低于CP高劑量組, 差異有統計學意義(P<0.05).

圖4 不同處理組小鼠腎臟MDA含量Fig.4 MDA content in mouse kidney of different groups

2.5 小鼠腎組織8-OHdG含量的變化

由圖5可見,與對照組比較,不同劑量的CP均能使小鼠腎8-OHdG含量有不同程度的升高.低劑量組(10mg/kg)差異無統計學意義,中、高劑量組(20,40mg/kg)差異有統計學意義(P<0.01),以上結果表明,在較高劑量的CP作用下,小鼠腎的8-OHdG含量升高明顯.CP+VE組8-OHdG含量低于CP高劑量組,差異有統計學意義(P<0.01).

圖5 不同處理組小鼠腎臟8-OHdG含量Fig.5 8-OHdG content in mouse kidney of different groups

圖6 不同處理組小鼠腎臟DPC系數含量Fig.6 DPC coefficient in mouse kidney of different groups

2.6 小鼠腎臟DPC系數的變化

用KCl-SDS沉淀法檢測DPC系數,其腎臟DPC系數變化如圖6所示.隨著CP染毒劑量的升高,DPC系數逐漸上升,呈一定的劑量-效應關系.低、中劑量組(10,20mg/kg)差異無統計學意義,高劑量組(40mg/kg)差異有統計學意義(P<0.01). CP+VE組DPC系數低于CP高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05).

3 討論

擬除蟲菊酯類殺蟲劑在施用過程中效率高,用量低,無明顯急性毒性作用.傳統觀點認為其在生物體內無蓄積效應,因而不會引起累積毒性效應.但隨著此類農藥的大量使用,其引起的亞急性和慢性毒性問題已受到學界和社會的廣泛關注.而CP作為該類農藥的典型代表,針對其毒性機制的研究是很有意義的.

腎臟組織切片結果顯示:對小鼠口服染毒1周后,隨著CP染毒劑量的升高,腎小管上皮細胞水腫程度逐漸加重,管腔逐漸變窄,腎小球逐漸肥大并且增生.說明CP可以引起腎組織病理性損傷,同時隨著染毒劑量的加大,腎組織病理損傷愈發嚴重,具一定劑量-效應關系.這種趨勢與CP致大鼠腎損傷的報道[13]一致.腎組織結構的病變同腎功能的下降有著必然的聯系,在此病變過程中生化水平的變化起著重要的作用.在加入抗氧化劑VE后,發現腎組織的病理學損傷明顯減輕,這暗示著氧化應激作用參與了腎組織的病變過程.

氧化損傷是多種疾病的重要發病機制,過量活性氧物質產生會導致機體產生氧化應激作用,直接或間接作用于胞內脂類、蛋白質及DNA等生物大分子,誘導改變它們的結構和功能,導致細胞死亡甚至組織損傷,最終使機體出現病變癥狀[14].機體的抗氧化系統能夠保護機體免受活性氧等自由基的損傷,還原型的GSH可以和ROS結合形成硫代半縮醛,并通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環生成具更強抗氧化作用的抗壞血酸[15].本研究中,40mg/kg CP組小鼠腎組織ROS水平顯著升高(P<0.05)、GSH含量顯著下降(P<0.05),說明高劑量CP可以使機體活性氧過量產生,同時大量損耗GSH,破壞機體氧化/抗氧化平衡造成了氧化損傷,進而損傷細胞內生物大分子.

過量的ROS可以使脂質發生過氧化反應,脂質過氧化作用最大危害是它可以引發鏈式反應,將氧化作用放大化,即少量的活性氧可以導致大量脂類過氧化產物產生.MDA是脂質過氧化反應的主要性和標志性產物,其水平的高低代表脂質過氧化的強度[16].MDA化學形式活潑,可與蛋白質或核酸分子中的氨基反應形成復合物導致細胞的氧化損傷,改變細胞膜的結構,使膜成分之間形成交聯和聚合,影響膜受體、膜離子通道的功能,甚至直接導致細胞死亡.在本研究中, 20mg/kg CP組MDA含量顯著上升(P<0.05),說明較高濃度CP水平誘導小鼠腎細胞發生脂質過氧化反應,細胞膜結構發生損傷.

8-OHdG是活性氧基團引起的DNA氧化損傷修飾產物,是國際上公認的一種新型評價DNA氧化損傷和氧化應激狀態敏感的生物標志物,測定機體8-OHdG含量對評估體內氧化損傷和修復程度有重要意義[17-18].ROS對細胞的氧化損傷作用還會引起DNA-蛋白質交聯,DNA-蛋白質交聯難以修復,增加染色體畸變和姊妹染色單體交換的發生率[19].在本研究中,40mg/kg CP組8-OHdG含量和DPC系數均顯著上升(P<0.01),說明高濃度CP可以引起小鼠腎組織DNA堿基點突變和DNA-蛋白質交聯物形成,對參與DNA復制、轉錄和修復相關蛋白活動可能起阻礙作用.

VE對機體的保護作用是通過VE作為電子供體存在于細胞表面,攔截具有強氧化能力的自由基,使細胞不被氧化而達到對細胞的保護作用.VE不僅本身具有抗氧化的能力,而且可以誘導機體提高超氧化物歧化酶(SOD)的作用,而SOD是氧自由基的主要清除劑,它能促使氧自由基的分解,并使自由基的形成和清除處于動態平衡,從而消除自由基對機體的危害[20].高劑量染毒加VE組與高劑量染毒組相比較,腎組織的ROS、MDA、8-OHdG的含量和DPC系數均有所下降,GSH含量上升,各指標差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01).說明VE的抗氧化作用顯著,能夠減輕CP對小鼠腎組織的氧化損傷.

4 結論

高濃度CP可使小鼠腎臟氧化應激/損傷生物標志物水平改變和組織損傷,導致腎臟毒性的發生,這種毒性作用可被VE所拮抗.表明氧化應激/損傷途徑在CP致小鼠腎組織損傷中起介導作用.

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Oxidative damage induced by cypermethrin in the kidney tissue of Kunming mice.

MA Ping1,2, ZHANG Zhong-jie1,JIAO Ming1, LIAO Wen-li1, CHEN Jiao-e1, YANG Xu2, WU Yang1,2*(1.College of Basic Medical, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China；2.Laboratory of Environment Biomedicine, School of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2958～2963

Kunming mice were randomly grouped into six groups and treated with orally administered drugsona daily base for a week. The groups included one solvent control group, three cypermethrin groups, one high dose cypermethrin plus vitamin E protection group and one vitamin E group. The exposure doses of cypermethrin groups were 10, 20 and 40mg/kg respectively. Some kidney tissues were then made into homogenates for the measurement of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH), 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) and malondialdehyde (MDA) contents. Meanwhile, DNA-protein crosslink (DPC) coefficients were detected from brain cell suspension.The kidney contents of ROS, MDA, 8-OHdG and DPC coefficients increased gradually in a dose-dependent manner, whereas GSH content decreased accordingly. In the exposure group with the dose of 20mg/kg, MDA contents and DPC coefficients were significantly higher than those of the control group (P<0.05); ROS (F=3.7044), GSH (F=3.4908), MDA (F=3.5851), 8-OhdG (F=11.7934) and DPC (F=6.9165) levels were significantly different in levels of each biomarker between 40mg/kg group and control group (P<0.05,P<0.01). Furthermore, the high-dosaged (20and 40mg/kg) group had increased glomerulus cells, proliferation and hypertrophy of glomerulus, hydrops of renal tubular epithelial cell, and narrow lumen. Administration of vitamin E (VE) to cypermethrin-treated mice reflected that ROS, MDA, 8-OHdG and DPC increased whereas GSH decreased (P<0.05,P<0.01). Cyermethrin at certain doses (≥20mg/kg) could induce oxidative stress in mice kidney, whereas vitamin E had antioxidant effects.

cypermethrin；vitamin E；reactive oxygen species；glutathione；malondialdehyde；8-hydroxy-2-deoxyguanosine；DNA-protein crosslinks；oxidative stress

X171.5

A

1000-6923(2014)11-2958-06

馬 萍(1968-),女,湖北陽新人,教授,碩士,研究方向為環境毒理學.發表論文26篇.

2013-12-31

湖北省教育廳科學技術研究項目(D20122803);教育部國家級大學生創新訓練計劃項目(201210927036)

* 責任作者, 講師, wysj2007@126.com