腫節風中總黃酮大孔樹脂吸附－脫吸附動力學研究

楊曉東

（湖南省懷化市第一人民醫院藥劑科，湖南 懷化 418000）

腫節風為金粟蘭科植物草珊瑚 Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全株，具清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效，臨床上用于治療腫瘤（晚期胰腺癌、消化系統惡性腫瘤和鼻部惡性腫瘤、白血病等）、細菌性痢疾、骨折及多種口腔疾病，療效良好[1－2]。酚類、鞣質、黃酮苷、香豆素和內酯等為腫節風的主要成分，其中總黃酮是其抗腫瘤的有效成分之一[3]。腫節風水提取液中總黃酮的初步純化后，選用大孔樹脂進一步純化，通過靜態吸附和動態吸附試驗，以總黃酮的比吸附量和解洗脫率為評價指標，進行多種大孔樹脂的篩選，最終確定選擇HPD－100型大孔樹脂。本試驗中對總黃酮在HPD－100型大孔樹脂上的吸附與脫吸附的動力學過程進行了研究，為確定大孔樹脂分離純化腫節風純化工藝條件（吸附終點與洗脫終點）提供科學依據。

1 儀器與材料

Lambda Bio 40型紫外分光光度儀；Mettler AE－200型電子分析天平。HPD－100型大孔吸附樹脂（滄洲寶恩化工有限公司）；腫節風藥材（湖南三湘中藥飲片有限公司）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100080－200707）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樹脂預處理

HPD－100濕法裝柱，在樹脂柱內加入高于樹脂層10 cm的乙醇，浸泡4 h后，放出浸液，以乙醇洗脫，至洗滌液在試管中加水稀釋不渾濁且用紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為止，再用水洗滌至無醇味，備用。

2.2 溶液制備

取腫節風適量，加14倍量水，煎提2.5 h，濾過；濾渣加12倍量水，煎提2 h，濾過，合并濾液；80℃以下減壓濃縮至提取液含生藥0.6 g/mL，加入乙醇使藥液含醇濃度達50%，靜置24 h，濾過，回收乙醇，濃縮至提取液含生藥0.6 g/mL，即得供試品溶液。精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品53.3 mg，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇20 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋，使乙醇濃度為70%，即得每1 mL中含無水蘆丁0.213 mg的對照品溶液。

2.3 標準曲線繪制

精密吸取質量濃度為0.213 g/L的蘆丁對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，各加甲醇至6.0 mL，加 5%亞硝酸鈉溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加 10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，取10 mL，以2 000 r/min的速率離心3 min，放置12 min。按2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅤB中分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為 Y＝2.013 X －0.013，r＝0.999 9(n＝6)。結果表明，蘆丁進樣量在 0.213 ～1.278 mg范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.4 總黃酮含量測定

精密量取2.2項下供試品溶液適量，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另各取相同量上述供試品溶液，置25 mL容量瓶中，不加顯色劑，直接加水至刻度，搖勻，作為空白對照品溶液。分別取上述供試品溶液、空白對照品溶液適量，在490 nm波長條件下測定其紫外吸收度。

2.5 動態吸附動力學試驗

取2.2項下供試品溶液適量，以2 BV/h的流速通過裝有5.6 g HPD －100型濕樹脂的玻璃柱（內徑 1 cm），每 1 BV（10 mL）流出液收集1份，按上述方法測定各份流出液中總黃酮的含量，并根據上柱前藥液的含量計算各份流出液中總黃酮的泄漏率。結果見表1。以流出液的份數（BV/份）為橫坐標、總黃酮的泄漏率（%）為縱坐標，繪制總黃酮在HPD－100型樹脂柱上的泄漏曲線，見圖1。

表1 總黃酮在HPD－100型樹脂柱上的泄漏率

圖1 總黃酮在HPD－100型樹脂上的泄漏曲線

2.6 動態脫吸附動力學試驗

取上述動態吸附動力學試驗中已吸附飽和的HPD－100型樹脂柱，先用4 BV的蒸餾水洗柱，再用50%乙醇溶液以8 BV/h流速進行洗脫，每1 BV流出液收集1份，同上測定各份流出液中總黃酮的含量，見表2。以洗脫液的份數為橫坐標、總黃酮的相對濃度（洗脫液中總黃酮濃度占上樣前藥液濃度的比值）為縱坐標，繪制總黃酮在HPD－100型樹脂柱上的洗脫曲線，結果見圖2。

表2 各流份洗脫液中總黃酮的含量

圖2 總黃酮在HPD－100型樹脂上的洗脫曲線

3 討論

預試驗中，對水提取液經過初步純化與不經過初步純化的大孔樹脂吸附分離純化進行了對比考察，結果發現，水提液經過初步純化后再上大孔樹脂進行吸附分離，總黃酮提取物的純度明顯提高，大孔樹脂的使用周期也明顯提高。因此，對水提液的初步純化有利于提高大孔樹脂吸附分離的效果，延長大孔樹脂的使用周期，有利于大孔樹脂的再生。

筆者通過靜態吸附和動態吸附試驗，以總黃酮的比吸附量和解洗脫率為評價指標，選用 PHD100，D －101，LSA －7，LSA －10，LSA－30，ADS－17，ADS－21，ADS－F8等8種樹脂進行了篩選，通過對比上述評價指標，并以總黃酮比吸附量和解洗脫率為縱坐標、藥液濃度為橫坐標繪制動態吸附和洗脫等溫曲線圖，最終確定選擇HPD－100型大孔樹脂。動態吸附動力學試驗結果顯示，腫節風提取液中總黃酮在HPD－100型樹脂上泄漏損失10%左右時，上樣的藥液體積約為 2 BV（即 20 mL），測定試驗所用HPD－100型樹脂的水分為64.2%，通過計算得每克 HPD－100型干樹脂約吸附10 mL。因此，可確定腫節風提取液以生藥量計質量濃度為0.6 g/mL時，在HPD－100型樹脂柱上的吸附終點為流出液達2 BV左右。另外，由動態脫吸附動力學試驗結果可知，在以50%乙醇為洗脫溶劑的情況下，洗脫液為5 BV時，腫節風提取液中總黃酮已基本洗脫完全，故可以此作為洗脫的終點。

大孔樹脂吸附法近年來已廣泛應用于各種植物和草藥的黃酮類分離純化。黃酮類化合物一般多具有酚羥基和糖苷鏈，有一定的極性和親水性、生成氫鍵的能力較強，有利于弱極性和極性樹脂的吸附。但在某些情況下吸附作用力強，解吸卻相當困難，所以選擇樹脂種類需綜合考慮吸附率、吸附速率、解吸率和產物得率及其黃酮含量等多方面因素[4－6]。

綜上所述，采用大孔樹脂動態吸附與脫吸附動力學研究，對腫節風提取液中有效部位在大孔樹脂上的分離純化過程進行有效控制，可為確定腫節風提取液在大孔吸附樹脂分離純化工藝的吸附終點與洗脫終點提供科學合理的依據。

參考文獻:

[1]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學（第二版）[M].北京:人民衛生出版社，1991:1 424.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:207.

[3]林 劍.草珊瑚中總黃酮甙對小鼠荷瘤的恢復作用[J].北京大學學報:自然科學版，1981（2）:80 －82.

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[5]郄冰冰，王 璐，郭瑞鋒，等.大孔吸附樹脂分離純化荷葉提取物[J].中國藥業，2007，16（20）:44 －45.

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