均勻設計法優化白藜蘆醇超臨界CO2流體萃取工藝

方耀平，秦郁文，唐富麗，董自亮

（1.太極集團西南藥業股份有限公司，重慶 400038； 2.太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000）

白藜蘆醇為一類多酚類物質，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，并以虎杖中的含量最高。白藜蘆醇具有廣泛的生物學活性和藥理作用，如誘導腫瘤細胞的凋亡[1－2]、抗菌[3]、抗心肌炎[4]以及免疫調節[5]等。此外，白藜蘆醇還具有抗輻射誘變損傷、抗衰老等作用，在食品、保健品、化妝品等領域也具有廣泛的應用價值。目前從虎杖中提取白藜蘆醇的方法多為有機溶劑提取，利用白藜蘆醇易溶于極性有機溶劑的性質，將其從原料中提取出來。但是，有機溶劑提取的粗品中含有大量的植物多糖、黃酮類化合物、色素、酚酸類等多種雜質，不利于后續工序的精制純化，且工序多、工藝煩瑣復雜；加熱時間長，使成品顏色加深，產品易氧化變質，穩定性差；有效成分收率較低；有機溶劑耗用量大，會造成嚴重的環境污染等問題[6]。超臨界流體萃取是近幾年發展起來的一項分離技術，具有無毒、無殘留溶劑、CO2可循環使用等優點，適合于不穩定天然產物和生理活性物質的分離與精制，已成為醫藥、食品和香料等深加工領域中獲得高品質產品的最有效手段之一[7]。目前，利用超臨界流體技術萃取虎杖中白藜蘆醇的報道尚不多見。為此，本試驗中對采用超臨界CO2萃取技術，采用均勻設計法，對從虎杖中萃取分離白藜蘆醇的工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

島津SPD－20A型高效液相色譜儀（LC－20AT）；BP2110型電子天平（德國賽多利斯公司）；SHB－3型循環水式真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；R－205型旋轉蒸發儀（上海申勝生物技術有限公司）；DJ－005型多功能粉碎機（山東精誠醫藥裝備制造有限公司）；HA221－50－06型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）。虎杖萃取物(批號為120806，自制)，白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為111535－200703）；乙腈、甲醇為色譜級，水為純蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 白藜蘆醇含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相:水 －乙腈（78 ∶22）；檢測波長:303 nm；流速:1.0 mL /min；柱溫:25 ℃；進樣量:10 μL。色譜峰見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h的白藜蘆醇對照品3.14 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（0.062 8 g/L）。精密量取對照品貯備液 1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得白藜蘆醇對照品溶液(每1 mL含白藜蘆醇6.28 μg)。取虎杖萃取物4 g，精密稱定，研細，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞稱定質量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置后精密量取上清液20 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密吸取對照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，以白藜蘆醇進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，作線性回歸，得回歸方程 Y＝334 331 X －348.6，R2＝0.999 8（n＝7）。結果表明，白藜蘆醇進樣量在0.012 55～0.125 6 μg范圍內與面積呈良好線性關系。

精密度試驗:取白藜蘆醇對照品溶液，依法連續測定6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.61%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批虎杖萃取物（批號為120806）樣品6份，按依法制備供試品溶液并測定。結果白藜蘆醇的平均含量為6.644 mg/g，RSD 為 1.23%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，室溫密閉放置，分別于制備后 0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定白藜蘆醇峰面積。結果的 RSD 為2.25%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品約2 g，共9份，依法制備供試品溶液并定容至200 mL，各取1 mL，分別加入定量的對照品溶液（質量濃度為 6.28 μg /mL）2.0，2.5，3.0 mL（約相當于樣品量得80%，100%，120%）各3份，分別按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結果見表1。

表1 虎杖萃取物中白藜蘆醇加樣回收試驗結果（n＝9）

2.2 超臨界CO2萃取工藝條件篩選

2.2.1 均勻設計試驗

采用均勻設計試驗優化超臨界－CO2萃取工藝參數。結合文獻[8]及預試驗結果，確定主要考察因素為萃取壓力（X1）、萃取時間（X2）、萃取溫度（X3）、夾帶劑（95% 乙醇）用量（X4）；萃取流量無法控制，設為定值。因試驗所用的藥材粒度不便進行統計分析，先用單因素方法考察最佳粒度，經含量測定，計算得以60目的提取效果為最佳。此試驗有4個因素，6個水平，選用 U6（64）表安排試驗，因素水平表見表2，均勻設計參數見表3。每次將250 g虎杖藥材粉（60目）投入萃取釜中，按均勻設計表設定的參數進行超臨界萃取。

采用 SAS 8.0統計軟件，運行后，Shapiro－Wilk統計量為0.888 1，P＝0.308 6＞0.05，模型服從正態分布，但 P（X1，X2，X3，X4）＞0.05，模型無統計量，無法建立逐步回歸方程，故建立二次多項式回歸方程，程序再次運行后，模型統計量 F＝147.68，P＝0.001 0＜0.01，逐步回歸方程有統計學意義。調整決定系數為R2＝0.983 2，回歸方程效果較好。X3，X1X2的偏回歸系數 t統計量分別為 3.55，16.09，P 值分別為 0.038 2，0.005，應當留在方程中。故建立回歸方程為 Y ＝3.022 19 ＋0.024 78X3＋0.0211 7X1X2。

由二次多項式回歸方程，X3，X1X2各項均為正號，X1，X2，X3應取試驗范圍的最大值，X4根據實際情況取最小值，最優點的近似估計值為 X1＝30，X2＝60，X3＝250，X4＝120。故最優方案的近似估計為萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑用量250 mL（即藥粉量的100%），萃取時間120 min。

2.2.2 均勻設計優化條件

根據均勻設計回歸方程，采用SAS 8.0軟件處理，得到了超臨界萃取白藜蘆醇的最優化操作條件為，萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，萃取時間120 min，夾帶劑用量（藥粉用量的100%），萃取率0.096 4%。該試驗條件下的方程預測值為0.097 7%，與實際值基本相同。

表2 均勻設計因素和水平

表3 均勻設計試驗及結果

3 討論

均勻設計法的特點是將有關試驗的水平數均勻分散在實驗范圍內，使有限的數據具有廣泛的代表性，因此可大幅度減少試驗次數。本研究采用均勻設計方法，對超臨界CO2流體萃取虎杖中白藜蘆醇的工藝條件進行優化，所得超臨界萃取白藜蘆醇的最佳工藝條件為萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑用量100%，萃取時間120 min。萃取過程中的壓力、溫度的變化對萃取率的影響起主要作用，因此控制好壓力和溫度的參數顯得尤為重要。超臨界二氧化碳萃取白藜蘆醇，同傳統萃取方式相比較，具有簡便、高效、環保、產物易于分離等特點，并且能獲得較高的萃取率，是一種很好的白藜蘆醇提取分離方法。此外，本研究建立的測定虎杖中白藜蘆醇含量的高效液相色譜(HPLC)法具有靈敏、準確、迅速和穩定、經濟等特點，可用于虎杖中白藜蘆醇的含量測定以及有效成分提取的質量控制。

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