益氣通便顆粒微生物限度檢查法研究

王洪水

(馬應龍藥業集團股份有限公司，湖北 武漢 430064)

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益氣通便顆粒微生物限度檢查法研究

王洪水

(馬應龍藥業集團股份有限公司，湖北 武漢 430064)

目的：建立益氣通便顆粒微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2010版附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，采用培養基稀釋法和常規法對三個批號的益氣通便顆粒進行微生物限度測定。結果：各菌種的回收率均大于70%，在控制菌常規法驗證中實驗組檢出試驗菌；通過方法學驗證表明，細菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養基稀釋法檢驗，控制菌可采用常規法進行檢驗。結論：建立的益氣通便顆粒微生物限度檢驗方法準確可靠、可行性強，能有效地對其進行微生物限度的測定。

益氣通便顆粒；常規法；培養基稀釋法；方法驗證

益氣通便顆粒為口服給藥制劑，由何首烏、枳殼、升麻、火麻仁、白術、炙黃芪、肉蓯蓉等七味中藥組成，具有益氣養陰、潤腸通便之功效。用于中老年氣陰兩虛、氣機升降失常、腸道失運引起的便秘，癥見大便干結，或大便稀軟難解，肛門墜脹，努掙無力，便后疲憊，舌淡胖而少津，或舌紅少苔，脈虛無力，或細澀無力。為了有效地對益氣通便顆粒進行微生物限度測定，準確檢出樣品中存活的微生物數量及致病菌種類[1-3],特研究了其微生物限度的檢查方法并進行了方法驗證。

1 實驗儀器、試藥

1.1 實驗菌種

白色念珠菌CMCC(F)98001、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、黑曲霉CMCC(F)98003、大腸埃希菌CMCC(B)44102由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 樣品

益氣通便顆粒(馬應龍藥業有限公司，批號：120601、131001、131101)。

1.3 培養基

玫瑰紅鈉瓊脂培養基(BR 021011)、MUG培養基、營養肉湯培養基(BR)、曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)(伊紅美藍瓊脂培養基)、營養瓊脂培養基(BR)、改良馬丁培養基(BR)、膽鹽乳糖培養基(BL)、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(OWD-M0151)以及0.9%無菌氯化鈉溶液等。

1.4 儀器

天平、培養箱、冰箱、微波爐、高壓滅菌鍋等。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

①取經35℃培養24h的大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養物1mL，加適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計數備用。②取經25℃培養24h以改良馬丁培養基培養的白色念珠菌液體培養物1mL，加適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計數備用。③將黑曲霉的新鮮培養物接種到斜面改良馬丁瓊脂培養基上，經25℃培養1周，加5mL0.9%無菌NaCl溶液洗下斜面的霉菌孢子，然后吸取洗下的孢子液用適量0.9%無菌NaCl溶液制成細菌數為50～100cfu/mL的菌液，備用。

2.2 供試液的制備方法

取樣品10g研碎，加入適量pH7.0的無菌NaCl-蛋白胨緩沖液使溶解并稀釋至100mL，制成1∶10的供試液備用；取以上供試液1mL注皿。常規法，取1∶10的供試液1mL注皿；培養基稀釋法，取1∶10的供試液1mL注入5個平皿中。

2.3 回收率試驗

菌液組：取上述各菌液1mL分別注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養120h；平行制備2個平皿，測定各菌株的實驗菌數。

試驗組：取上述供試液和不同菌液各1mL分別注入同一平皿中，平行制備2個平皿。立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養120h；平行制備2個平皿，測定各菌株的實驗菌數。

供試品對照組：取上述供試液1mL注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養120h；平行制備2個平皿，測定供試品本底菌數。

稀釋劑對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL和上述不同菌液1mL，分別注入同一平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細菌35℃培養72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養120h；平行制備2個平皿，考察稀釋劑對試驗有無干擾。該對照組各試驗菌的回收菌應不低于70%。

2.4 驗證方法

2.4.1 常規法 取3個批號的益氣通便顆粒，按常規法測定每一株菌的實驗菌數，并分別計算各試驗菌的回收率。結果表明，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌和黑曲霉回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌回收率小于70%[4]，表明益氣通便顆粒對細菌的生長有一定的抑制作用。對霉菌和酵母菌的生長無抑制作用，可采用常規法進行霉菌和酵母菌測定，采用常規法進行細菌數測定檢驗不可行。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑對照組回收率超過70%，表明稀釋劑無抑菌作用，對實驗應無干擾。結果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌的計數方法常規法驗證結果的回收率 (cfu/mL)

2.4.2 培養基稀釋法 根據常規法預試驗結果顯示，益氣通便顆粒對細菌有一定的抑制作用，采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)進行進一步試驗[5-6]。結果表明，金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋法回收率為75%，大于70%，表明經采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)能有效消除益氣通便顆粒對細菌的抑制作用，采用培養基稀釋法(0.2mL/皿)進行細菌計數測定應可行。結果見表2。

表2 細菌、霉菌及酵母菌的計數方法培養基稀釋法驗證結果的回收率 (cfu/mL)

根據上述實驗，初步確定益氣通便顆粒細菌計數方法為培養基稀釋法(0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌計數方法為常規法。

2.4.3 控制菌檢查方法的驗證[7]試驗組：分別取上述供試液10mL、大腸埃希菌1mL接種到同一100mL的膽鹽乳糖培養基中，移至35℃培養24h左右，取以上培養物0.2mL接種到5mLMUG培養基上，于366nm紫外燈下分別在5h、24h觀察熒光；然后進行靛基質試驗。另取培養物接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基上，至35℃培養18～24h，觀察菌落形態。試驗結果見表3。

陰性對照組：取上述制好備用的金黃色葡萄球菌1mL接種到100mL的膽鹽乳糖培養基中，方法同試驗組進行檢查。

表3 控制菌的驗證結果

結果表明按常規法檢查，益氣通便顆粒對大腸埃希菌的生長無抑制作用，可采用常規法進行控制菌的檢查。

根據上述實驗結果，益氣通便顆粒微生物限度檢查方法可為：

微生物限度：照微生物限度檢查法(中國藥典2010版一部附錄ⅩⅢC)取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，混勻，作為1∶10的供試液。

細菌數：取1∶10的供試液1mL注入5個平皿中，平行制備10個平皿，按平皿法測定。

霉菌和酵母菌數：取1∶10的供試液1mL注入1平皿中，平行制備2平皿，按平皿法測定。

大腸埃希菌:取1∶10的供試液10mL加入100mL膽酸乳糖培養基中，低度法檢查。

細菌數每1g不得超過1 000cfu，霉菌和酵母菌數每1g不得超過100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。

3 討論

益氣通便顆粒對細菌有一定的抑制作用，采用常規法不能有效消除益氣通便顆粒對細菌的抑制作用，需進一步采用培養基稀釋法進行驗證；通過方法學驗證，本品的細菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養基稀釋法檢驗，控制菌可采用常規法進行檢驗；另本品對大腸埃希菌無抑菌作用，故控制菌可采用常規法進行檢驗。通過以上微生物限度檢驗方法的研究，建立了合理可行的檢驗方法，為微生物限度檢測方法的建立提供了有利的依據。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社,2010：附錄ⅧC79-88.

[2] 中國食品藥品檢定研究院．中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：北京中醫藥科技出版社,2005:362-403.

[3] 蔣小云，張先文，陶俊鈺．感冒退熱顆粒微生物限度檢查方法學驗證[J]．安徽醫藥，2008,12(2)：123-125．

[4] 闞秀燕,李妍.4 種中成藥微生物限度檢查法中細菌霉菌(酵母菌)計數的方法驗證[J].中華中醫藥學刊,2007(11):14-16.

[5] 劉雅清．板車消炎顆粒微生物限度檢查法的驗證[J]．中國實用醫藥，2011，6(4)，267-268 ．

[6] 詹云麗.對影響微生物限度檢查結果若干因素的探討[J].中國藥師,2003,6(6):21-23.

[7] 王知堅,邵惠琴,杜蕓,等.藥品微生物限度檢查法有效性驗證實驗研究[J].中國現代應用藥學,2004,21(3):211-213.

(責任編輯：李嵐春)

Study on the Method of Microbial Limit Test of Yiqitongbian Grain

Wang Hongshui

(Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Stock Co.,LTD，Hubei 430064)

Objective:To establish the method of microbial limit test of Yiqitongbian grain.Methods:According to theChinaPharmacopoeia2010 Edition appendix of microbial limit test method test guideline,use the culture medium dilution method and the routine method to determine the microbial limits of Yiqitongbian grain.Results:The recovery of the strain rate was more than 70%,the experimental group were verified by test bacteria in the control bacterium of conventional method;by method validation indicated that bacteria,mil-dew and yeast inspection,medium dilution can be used to control bacteria,mildew and yeast′s inspection of bacteria test,the routine method can be used to check Controling bacteria.Conclusion:The established Yiqitongbian grain of microbial limit test method is accurate,reliable,feasible,and can carry out the measurement of microbial limit for its effective.

Yiqitongbian Grain; The Routine Method; Culture Medium Dilution Method; Method Validation

2014-01-21

王洪水(1971-)，男，湖北馬應龍藥業集團股份有限公司工程師、執業藥師，研究方向為中藥提取。

R284

A

1673-2197(2014)08-0037-02