刺玫根不同提取物體外抗氧化能力研究

劉 晶，邸子真，王光函，尤獻民

(遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

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刺玫根不同提取物體外抗氧化能力研究

劉 晶，邸子真，王光函，尤獻民*

(遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的：初步探討刺玫根不同極性提取物的體外抗氧化活性。方法：采用分光光度法測定刺玫根不同極性提取物的總還原性，及其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除作用。結果：建立了刺玫根不同極性提取物的總還原性曲線和DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子抑制曲線。結論：初步明確了刺玫根不同極性提取物的抗氧化能力，其萃取后的乙酸乙酯、正丁醇提取物抗氧化能力有所增強。

刺玫根；提取物；體外抗氧化活性

刺玫根為薔薇科植物山刺玫RosadavuricaPall.的根，又名刺葛薔薇根、野玫瑰根，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西等地，資源豐富。該藥具有止血及廣譜抗菌作用，可用于治療經血不止、功能性子宮出血、腸炎、細菌性痢疾和腎炎等疾病[1]。本研究在水提取刺玫根后，用不同極性的有機溶劑萃取水提液[2]，得到刺玫根不同極性的有效成分，對其進行體外抗氧化實驗，為研究刺玫根的抗氧化作用提供依據。

1 儀器與試劑

儀器：721型分光光度計(山東高密彩虹儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(上海亞容生化儀器廠)，恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環宇科學儀器廠)，KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試劑：DPPH、2，6-二叔丁基對甲酚 (BHT)、抗壞血酸 (VC)、還原型輔酶I(NADH I)、氮藍四唑(NBT)、酚嗪硫酸甲酯(PMS)、沒食子酸、番紅均為sigma公司產品；鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、EDTANa2、FeSO4·7H2O、H2O2均為分析純，購于沈陽試劑一廠。

2 方法與結果

2.1 不同極性供試品溶液制備

取藥材2kg，劈碎，浸泡半小時，加10倍量水提取2次，每次2h，濃縮至1g/mL藥液，取1 000mL提取液蒸干，得刺玫根水提物。剩余藥液加等量95%乙醇放置過夜，虹吸上清液，沉淀干燥得到刺玫根醇沉物。上清液回收乙醇至無醇味，加水至1 000mL，加入等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯至干，加入適量70%乙醇溶解，糊精拌樣，得到刺玫根乙酸乙酯提取物(1∶20)；萃取后水提液加入等量正丁醇，萃取4次，合并萃取液，回收正丁醇至干，加入適量70%乙醇溶解，糊精拌樣，得到刺玫根正丁醇提取物(1∶10)。將不同極性提取液分別配置成適當濃度梯度系列溶液，備用。

2.2 不同提取物清除DPPH自由基測定[3-4]

DPPH是一種很穩定的以氮為中心的自由基，若提取物能將其清除，則表明該提取物能降低烷基自由基濃度，阻斷脂質過氧化鏈反應。分別取不同濃度供試液2mL，加入0.1mmol/DPPH溶液2mL，渦旋混勻后，室溫放置30min，于517nm波長下測定吸光度值，計算抑制率，計算公式為：(A對-A樣)/A對×100%。以VC為陽性對照，95%乙醇為空白，以95%乙醇代替藥液。以清除率為縱坐標，以濃度(μg/mL)為橫坐標作圖，所得清除曲線如圖1所示。相近濃度下乙酸乙酯層和正丁醇層的DPPH自由基清除能力均優于陽性對照VC。

圖1 不同濃度提取物DPPH自由基清除曲線

2.3 不同提取物對超氧陰離子清除作用[5]

超氧陰離子自由基可將NBT還原為藍色物質，其在560nm波長處有吸收。利用該原理，分別在試管中加入259μmol/L NADH I溶液0.9mL、163μmol/L NBT溶液0.9mL、52.8μmol/L PMS溶液0.3mL，后立即加入不同濃度樣品0.3mL，渦旋混勻后，室溫放置5min，于560nm波長下測定吸光度.(空白不加PMS，對照不加樣品)，計算抑制率,計算公式為(A對-A樣)/A對×100%。以沒食子酸為陽性對照，以清除率為縱坐標，以濃度(μg/mL)為橫坐標作圖，清除曲線如圖2所示。在相近濃度下，乙酸乙酯層和正丁醇層對超氧陰離子的清除能力均優于陽性對照沒食子酸。

圖2 不同濃度提取物超氧陰離子自由基清除曲線

2.4 不同提取物抑制羥自由基作用[6-7]

在生命代謝過程產生的自由基中，OH·是最活潑的活性氧，氧化能力極強。本實驗采用Fenton法測定不同極性提取物溶液對羥自由基的抑制作用。本實驗的原理為H2O2與Fe2+作用產生羥自由基，可使番紅褪色，減小其在520nm下的吸光度。各管中分別加入0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.5mL、520μg/mL番紅300μL、2mmol/L EDTANa2-Fe2+200μL、不同濃度的樣品，最后加入6%H2O2200μL，混勻后40℃水浴40min，于517nm下測定吸光度(空白以蒸餾水代替藥液，對照以蒸餾水代替EDTANa2-Fe2+和藥液)，計算抑制率，計算公式為(A樣-A空)/(A對-A空)×100%。以VC為陽性對照，以清除率為縱坐標，以濃度為橫坐標作圖，清除曲線如圖3所示。正丁醇、水層、乙酸乙酯層對羥自由基的抑制作用均優于陽性對照VC。

圖3 不同濃度提取物羥自由基清除曲線

2.5 不同提取物總還原性測定[8]

鐵氰化鉀被還原為亞鐵氰化鉀后，可與三氯化鐵作用，生成亞鐵氰化鐵，在700nm處可測定其吸光度，吸光度值越大，表明其還原性越強。取不同濃度供試液各1mL，分別與2.5mL磷酸緩沖液混合后，加入2.5mL 1%鐵氰化鉀，置于50℃水浴鍋中加熱20min，再加入1mL 10%三氯乙酸，混勻后取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1% FeCl30.5mL，于700nm波長處測定吸光度。以VC為陽性對照，以吸光度為縱坐標，以濃度為橫坐標作圖，總還原曲線如圖4所示。在相近濃度下，正丁醇層的總還原性均優于陽性VC，乙酸乙酯層總還原性與VC接近。

圖4 不同濃度提取物總還原性曲線

3 結論

山刺玫為薔薇科植物，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西等地，資源豐富，其根、花和果實均可入藥。目前對山刺玫的研究多集中在刺玫果上，對刺玫根的研究較少。本實驗首次對刺玫根及其不同極性提取物進行了系統的抗氧化活性研究。

刺玫根不同極性提取物對自由基的清除作用均表現出一定的濃度依賴性，但在清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子試驗中，當濃度升高到一定程度后，其清除率不再隨著濃度的增大而增大，而是進入了一個平臺期。

本試驗中，根據極性的不同，采用不同溶劑萃取法，將刺玫根水提物劃分為不同極性有效部分，分別進行抗氧化試驗。在清除DPPH自由基試驗中，其清除能力大小依次為乙酸乙酯層、正丁醇層、醇沉層、水層；在清除超氧陰離子試驗中，其清除能力大小依次為正丁醇層、乙酸乙酯層、醇沉層、水層；在抑制羥自由基試驗中，其抑制能力大小依次為正丁醇層、水層、乙酸乙酯層、醇沉層；在總還原性試驗中，其還原能力大小依次為正丁醇層、乙酸乙酯層、水層、醇沉層。在不同的抗氧化試驗中，不同提取物的抗氧化能力大小有所差異，造成該現象的原因可能是萃取法只是根據極性對刺枚根中的有效成分進行大致分類，每一層中仍含有多種有效成分。進行不同抗氧化活性實驗時，每種成分發揮的作用大小不同，所以累積起來表現出的綜合效果也有所不同。但總體來說，經過萃取后，正丁醇層和乙酸乙酯層提取物的抗氧化能力均有較大提高，甚至超過了陽性對照品。該實驗為刺玫根中抗氧化活性物質的進一步提取分離指明了方向。

[1] 謝曉燕,貢濟宇,王立巖.山刺玫根的生藥學研究[J].時珍國醫國藥,2007,18(9):2112-2113.

[2] 徐正斌,郭秀芳,史久良.刺玫根治療慢性氣管炎有效部位的探討[J].黑龍江醫藥,1983(3):51-52.

[3] 師梅梅,楊建雄.龍血竭膠囊的體外抗氧化研究[J].中成藥,2007,29(11):1591-1594.

[4] 王輝,孫春艷,劉剛.異心蓮的體外抗氧化活性[J].中國生化藥物雜志,2005,26(1):21-23.

[5] 管福琴,劉敏,單宇,等.灰氈毛忍冬中五環三萜類化合物的抗氧化活性研究[J].時珍國醫國藥,2013,24(6):1315-1317.

[6] 莫正昌,鄧 靖,汲廣全,等.鹿蹄草提取物體外抗氧化活性評價[J].食品科學,2010,31(3):19-20.

[7] 崔月花,章克昌.靈芝三萜皂苷( GCTL1) 的體外抗氧化作用[J].食品科學,2010,31(19): 49-51.

[8] 謝廣發,朱成鋼,胡志明,等.黃酒的體外抗氧化及其機理研究[J].食品與發酵工業,2005,31(10):5-9.

(責任編輯：尹晨茹)

Study on Anti-oxidation Activity in Vitro ofRosadavuricaPall.Extracts

Liu Jing,Di Zizhen,Wang Guanghan,You Xianmin*

(Liaoning Traditional Chinese Medicine Institute, Shenyang 110034,China)

Objective:Discuss the anti-oxidation effects in vitro ofRosadavuricaPall. extracts. Methods:The anti-oxidation effects ofRosadavuricaPall. extracts were determined by The UV spectrophotometry. the anti-oxidation effects in vitro were analyzed by different assay such as total reducing power,DPPH radical scavenging assay,hydroxyl radical scavenging assay and superoxide radical scavenging assay. Results:Obtained the curve of total reducing power,DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide radical scavenging respectively. Conclusion:Initially clear the anti-oxidation activity in vitro ofRosadavuricaPall. The Anti-oxidation Activity in Vitro of Ethyl acetate and Butanol Extracts were strengthened.

RosadavuricaPall.;Extracts;Anti-oxidation Effects in Vitro

2014-02-17

國家“十二五”重大新藥創制項目(2012ZX09303-017)

劉晶(1980-)，女，碩士，遼寧省中醫藥研究院助理研究員，研究方向為中藥新藥開發。

尤獻民(1964-)，男，遼寧省中醫藥研究院研究員，研究方向為中藥質量控制。E-mail：18940158727@126.com。

R285.5

A

1673-2197(2014)10-0030-02