中藥益智仁鹽炙對正常大鼠結腸水通道蛋白4影響研究

王 瑾，譚茂蘭，汪云偉，黃勤挽

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

?

中藥益智仁鹽炙對正常大鼠結腸水通道蛋白4影響研究

王 瑾，譚茂蘭，汪云偉，黃勤挽*

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

目的：觀察益智仁鹽炙對正常大鼠結腸水通道蛋白4(AQP4)的影響，研究益智仁燥性及鹽炙潤燥的作用機制。方法：將SPF級SD大鼠分為正常動物組、生益智仁組、鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組及生益智仁加增液湯組，各組動物每天灌胃給藥1次，連續28 天。于第28天處死動物，剖取結腸組織，采用免疫組織化學檢測結腸中AQP4 的表達情況。結果：與正常動物組比較，生益智仁組結腸AQP4表達顯著增加(P<0.01)；與生益智組比較，鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組及生益智仁加增液湯組結腸AQP4表達均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，差異均具有統計學意義。結論：益智仁能增加正常大鼠結腸AQP4表達，促進腸道水分重吸收，從而造成便秘，體現其燥性效應；而益智仁鹽炙后能降低其引起的燥性效應，其作用機制與鹽炙過程中的加熱炒制和輔料食鹽有關。關鍵詞：益智仁；鹽炙；大鼠結腸；水通道蛋白4

益智為姜科山姜屬植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果實，藥用部位為種仁。益智仁藥用歷史悠久，中醫傳統用藥經驗認為其生品辛溫而燥，長于溫脾止瀉、攝涎唾力勝；而鹽炙后其辛燥之性減弱，專行下焦，長于固精、縮尿。課題組前期研究表明，益智仁對小鼠腸腔水分,特別是大腸腸腔水分有顯著的減少作用，說明益智仁引起動物出現便秘癥狀原因之一為加強小腸、大腸腸腔水分的重吸收[1]。水通道蛋白是一類具有高度選擇性的運輸水的膜通道蛋白家族，在哺乳動物組織中已發現13種水通道蛋白亞型[2]，其中水通道蛋白3、4、8(AQP3、AQP4、AQP8)等在結腸中分布表達并參與結腸水分重吸收過程[3-4]。

益智仁促進腸道水分重吸收的機制是否與AQP4有關？鹽炙后有何影響？影響的關鍵環節是什么？上述問題均無相關報道。本文觀察了灌胃給予正常大鼠益智仁、鹽益智仁對其結腸組織AQP4表達的影響，現報道如下。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Motic BA400顯微攝像系統(麥克奧迪公司)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；QYC-200型恒溫搖床(上海福瑪公司)；徠卡-2015切片機(德國克林藍公司)；TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫療儀器有限公司)；Image-Pro Plus圖像分析系統(Media Cybernetics，Inc.公司)。

1.2 藥材與供試品制備

益智AlpiniaoxyphyllaMiq.購于海南省中藥材公司，經成都中醫藥大學中藥標本中心盧先明教授鑒定為益智，符合《中國藥典》2010年版相關規定，將其制備成生益智仁、鹽益智仁、清水炒益智仁3種飲片，分別用70%乙醇提取，回收乙醇，分別制備成2g·mL-1、1g·mL-1藥液；取部分1g·mL-1生益智仁藥液，按2%(w/v)加入食鹽；另購玄參、麥冬、生地3種飲片，按《溫病條辨》中“增液湯”配方，煎煮濃縮至2g·mL-1藥液，與2g·mL-1生益智仁藥液等體積混合。上述各藥液中均加入5%(v/v)吐溫-80增溶。

1.3 試劑試藥

AQP4(H-80)抗體(批號：ZS-20812)；a Rb IgG(H+L)/Bio抗體(生物素化山羊抗兔IgG)(批號：V0527)；a Mo IgG(H+L)/Bio抗體(生物素化山羊抗小鼠IgG)(批號：V0522)；辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白(HRP/A-V)(批號：V7023)；DAB顯色劑(批號：753223A)，均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。PBS緩沖液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L。

1.4 動物

SD大鼠，SPF級，體重180～220g，雄性，由成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號SCXK(川)2013-24。

2 方法

2.1 分組及給藥

將大鼠按體重隨機分成6組，即空白對照組、生益智仁組、鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組、生益智仁加增液湯組，每組6只。空白對照組灌胃給予純水，益智仁各給藥組分別給予相應藥液，給藥劑量均為20mL·kg-1。每天灌胃給藥1次，連續28 天。

2.2 結腸組織制片

于第28天末次給藥后1h，用水合氯醛(0.35g·kg-1)麻醉動物，行腹中線剖開，在右側橫狀結腸處采集約1cm長的腸管，用4%多聚甲醛溶液固定，備APES處理的載玻片，常規石蠟切片，切片厚度約6～8μm。

2.3 結腸組織AQP4免疫組織化學檢測

采用免疫組織化學的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(S-P法)檢測大鼠結腸組織AQP4蛋白表達情況。石蠟切片常規脫蠟至水，加3% H2O2溶液于玻片上，室溫靜置10min以清除內源性過氧化酶，用蒸餾水洗3次，每次2min。將切片浸入含0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)的容器中，置于微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92～98℃之間并持續10～15min，取出容器置于室溫冷卻后用PBS緩沖液洗滌2次。切片滴加5% BSA 1滴封閉，在37℃下溫育20min，甩去多余液體，不洗。滴加1∶200稀釋的一抗(AQP4抗體)，4℃過夜，用PBS洗滌3次，每次2min；滴加二抗(生物素化山羊抗兔IgG和生物素化山羊抗小鼠IgG)，37℃孵育30min，用PBS洗滌3次，每次2min；滴加辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白工作液，37℃孵育30min，用PBS洗滌4次，每次5min。DAB顯色2min，蒸餾水洗滌。用蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

2.4 陽性細胞圖像分析處理

用Image-Pro Plus圖像分析系統進行陽性細胞積分光密度(MD)分析。

2.5 統計學分析

3 結果

陽性產物為棕黃色至黃色顆粒，位于細胞質中，細胞漿及細胞核周圍呈棕黃色者判為陽性，陰性細胞核為藍色。與正常動物組比較，生益智仁組AQP4積分光密度顯著增大(P<0.01)；與生益智仁組比較，鹽益智仁組、生益智仁聯用增液湯組AQP4積分光密度顯著減小(P<0.01)，清水炒益智仁組、生益智仁外加鹽組AQP4積分光密度顯著減小(P<0.05)，差異均具有統計學意義。結果見表1和圖1。

表1 益智仁鹽炙對大鼠結腸AQP4積分光密度影響 ±s，n=6)

注：生益智仁組與空白對照組比較，**P<0.01；其余各給藥組與生益智仁組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

圖1 大鼠結腸AQP4免疫組化結果

4 討論

《中國藥典》2010年版一部“益智”項下規定，益智仁單日用量為3～10g，若按成人日服最大用量10g、體重按50kg計算，則本實驗所用生益智仁10g·kg-1的劑量相當于成人日服最大劑量的50倍。在該劑量下，連續灌胃給藥正常大鼠28天，與正常動物組比較，大鼠結腸組織AQP4積分光密度顯著增大，說明大鼠結腸組織AQP4表達有所加強，進而結腸組織腸道水分重吸收加強，糞便含水量降低，體現出益智仁對正常大鼠腸道的燥性效應。

益智仁經過鹽炙后，能夠顯著降低因生益智仁導致的大鼠結腸組織AQP4表達增強效應，即能夠降低生益智仁對腸道的燥性效應，體現鹽炙潤燥的炮制作用原理。將鹽炙的關鍵作用環節分解為加熱作用和輔料作用，通過比較僅有加熱作用的樣品(清水炒益智仁組)和僅有輔料作用的樣品(益智仁加鹽組)，發現兩者與生益智仁相比，均能夠顯著降低因生益智仁導致的大鼠結腸組織AQP4表達增強效應，但作用強度不及鹽益智仁組，故表明鹽炙潤燥是加熱炒制和食鹽輔料共同導致的協同作用。

增液湯為中醫臨床治療燥證的基礎方劑，將其與生益智仁聯合用藥，能夠顯著降低因生益智仁導致的大鼠結腸組織AQP4表達增強效應，起到滋陰潤燥的作用，亦為本實驗結果的可靠性做了驗證。

[1] 劉靜,黃勤挽,王瑾,等.基于正常小鼠排便作用的益智仁燥性效應表征研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(23):231-234.

[2] 楊文茜,潘冰冰,王云姣.水通道蛋白4的研究進展[J].中國實用醫藥,2009,4(20):238-241.

[3] 汪泳,張方信,令曉玲,等.大鼠結腸中水通道蛋白4的表達與分布[J].第四軍醫大學學報, 2004,25(2):142-143.

[4] 吳本升,楊柏霖,周錦勇,等.“養陰潤腸方”對慢傳輸便秘模型大鼠結腸黏膜水通道蛋白3和水通道蛋白8的影響[J].江蘇中醫藥,2013,45(4):66-68.

(責任編輯：尹晨茹)

Effect study ofFructusAlpiniaeOxyphyllae Stir-frying With Salt Water on AQP4 of Normal Rats Colon

Wang Jin,Tan Maolan,Wang Yunwei,Huang Qinwan*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To study the effect of Fructus Alpiniae Oxyphyllae (FAO) Stir-frying with Salt Water on AQP4 of normal rats colon, so as to study the mechanism of dry effects and salt-processed moistening-dryness of FAO stir-frying with salt water.Methods:The SPF rats were divided into 6 groups: normal group, crude FAO group, FAO stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group. All rats were orally administered once a day for 28 d. All rats were sacrificed on the 28th day, and dissected the colon, then detected the expression of AQP4 of colon by immunohistochemistry.Results:Compared with normal group, the expression of AQP4 of crude FAO group were increased significantly(P<0.01); compared with crude FAO group, the expression of AQP4 of FAO Stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group were decreased significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion:FAO can increase the expression of AQP4 of normal animal colon, to promote intestinal reabsorption of water, then lead to constipation and reflect its dry effects; However, FAO stir-frying with salt water can reduce its dry effects by FAO, the mechanism was related to stir-frying and salt in the process of stir-frying with salt water.

Fructus Alpiniae Oxyphyllae;Stir-frying With Salt Water; Rats Colon; AQP4

2014-02-18

國家自然科學基金(81001639)；教育部新教師基金(2010513120002)

王瑾(1983-)，女，成都中醫藥大學助理研究員，研究方向為中藥學。

黃勤挽(1979-)，男，博士，成都中醫藥大學副教授，研究方向為中藥炮制學。

R283;R285.5

A

1673-2197(2014)10-0010-02