女貞子對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用研究

徐希娟，楊中林

(中國藥科大學(xué) 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

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女貞子對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用研究

徐希娟，楊中林*

(中國藥科大學(xué) 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：探討女貞子是否對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。方法：采用MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞作為帕金森病體外模型，同時給予不同濃度的女貞子醇提液、水提液。通過MTT法測定細(xì)胞存活率，通過超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒來檢測女貞子對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。結(jié)果：與正常組相比，模型組細(xì)胞的細(xì)胞存活率顯著下降，SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，濃度為1mg/mL的女貞子水提液顯著提高細(xì)胞存活率，顯著降低SOD抑制率、NO含量、MDA含量及LDH水平。結(jié)論：女貞子水提液對細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。

女貞子；PC12細(xì)胞；MPP+；氧化應(yīng)激損傷

帕金森病(Parkinson disease，PD)是指通過病史或客觀檢查找不出能夠解釋那些臨床癥狀原因的疾病，其癥狀和體征通常是兩側(cè)不對稱的，同時對多巴胺治療有效，也稱原發(fā)性帕金森病[1]。近年來研究證明，中腦黑質(zhì)部位氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)及抗氧化保護(hù)機(jī)制減弱可能是引起發(fā)病的重要機(jī)制之一[2]。女貞子提取液能明顯地改善D-半乳糖引起的衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、減少氧化脂質(zhì)生成的作用[3]。而氧化應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，故推測女貞子對抗帕金森病具有一定的作用。本實驗以MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞為模型，探索女貞子對其是否具有保護(hù)作用，為其應(yīng)用于帕金森病的防治提供依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 實驗儀器

Forma311系列直熱式CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，USA)，超凈工作臺(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)，COIC XDS-1B型倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，Synergy2型酶標(biāo)儀(Biotek公司)，TGL-16型高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，YXQ-SG41-280型電熱提壓力蒸汽消毒器(上海醫(yī)用核子儀器廠)，TB-25型十萬分之一電子天平(Sartorius，USA)。

1.2 細(xì)胞株

PC12細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈。

1.3 藥物與試劑

女貞子藥材(購于江蘇省南京市先聲再康藥業(yè)，經(jīng)本人鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實)，MPP+iodide(Sigma公司，產(chǎn)品編號81512)，DMEM高糖培養(yǎng)基(GBICO，批號1031719)，四季青胎牛血清(四季青公司，批號110419)，胰蛋白酶(GIBCO，批號27250018)，二甲基亞砜(南京化學(xué)試劑有限公司，批號P1059733)，Western 及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，批號P0013)。

1.4 試劑盒

SOD試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司，批號20130928)；MDA劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司，批號20130925)；LDH試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司，批號20131008)；NO試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司，批號20130930)。

2 實驗方法

2.1 樣品液及試劑配制

2.1.1 樣品液的制備 取女貞子藥材10g，加10倍量水浸泡2h，10、9、8倍量蒸餾水直火煎煮3次，分別煎煮2.5、2.0、1.5h，合并提取液，濃縮，減壓干燥后得水提物。取女貞子藥材10g，加10倍量70%的乙醇浸泡2h，10、9、8倍量70%的乙醇85℃回流3次，分別回流2.5、2.0、1.5h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后得醇提物。稱取上述兩種提取物適量，給藥前用DMEM高糖培養(yǎng)基制成濃度分別為1、0.1、0.01mg/mL的樣品溶液。

2.1.2 MPP+溶液的配制 稱取一定量MPP+iodide，加入10mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，渦旋溶解，得濃度為20mmol/L的MPP+母液，用無菌濾膜過濾，置冰箱內(nèi)-20℃保存，備用。

2.1.3 普拉克索溶液的配制 精密稱取一定量普拉克索粉末，用DMEM高糖培養(yǎng)基溶解，得濃度為1×10-2mol/L的母液，用無菌濾膜過濾，置冰箱內(nèi)保存，備用，使用時用培養(yǎng)液稀釋到相應(yīng)的濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天傳代1次。

2.3 細(xì)胞活性的測定

將PC12細(xì)胞以3×104cell/mL的密度接種于96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)24h后給藥。實驗組分別加入濃度為1、0.1、0.01mg生藥/mL的水提物與70%醇提物，陽性藥組加入等體積終濃度為1×10-7mol/L的普拉克索，空白對照組加入等體積的DMEM高糖培養(yǎng)基；除空白組，每組加入終濃度為2mmol/L的MPP+溶液；每組均設(shè)6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)44h，每孔加入濃度為5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃孵化4h，有藍(lán)紫色沉淀生成。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL/孔DMSO溶解，振蕩搖勻10min，置酶標(biāo)儀上570nm處測各孔光吸收值OD。

2.4 氧化應(yīng)激水平測定

將PC12細(xì)胞以5×104cell/mL密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，培養(yǎng)24h后給藥。實驗組分別加入濃度為1mg生藥/mL的水提物與70%醇提物，陽性藥組加入等體積終濃度為1×10-7mol/L的普拉克索溶液，空白對照組加入等體積的不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；除空白組，每組加入終濃度為2mmol/L的MPP+溶液；每組均設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，將板取出，從各孔中精密吸取培養(yǎng)液，按照NO、LDH試劑盒進(jìn)行檢測。細(xì)胞上清取完之后，棄去剩余培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入裂解液100μL，在冰上裂解30min，收集裂解液，按SOD、MDA試劑盒分別進(jìn)行測定。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 細(xì)胞活性測定

由表1可知，經(jīng)MPP+誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率極顯著降低，說明造模成功。1mg/mL的水提物與70%乙醇提取物明顯能提高細(xì)胞活性，細(xì)胞存活率顯著高于模型組(P<0.05)，其它各濃度的女貞子提取物對PC12細(xì)胞的活性無顯著保護(hù)作用。陽性藥組細(xì)胞存活率低于女貞子組，說明1mg/mL的水提物與70%乙醇提取物能提高PC12細(xì)胞活性，且作用優(yōu)于陽性藥普拉克索。

3.2 氧化應(yīng)激水平測定

由表2可知，模型組各指標(biāo)與正常組相比具有顯著性差異，說明造模成功。1mg/mL的女貞子水提物能顯著性減小SOD抑制率，降低MDA、NO與LDH含量及水平，70%乙醇提取物只能顯著性降低MDA含量。陽性藥組只有MDA與NO顯著降低。實驗結(jié)果說明1mg/mL的女貞子水提物能夠抗氧化應(yīng)激，且其作用優(yōu)于陽性藥普拉克索。

表1 女貞子各提取物對PC12細(xì)胞存活率的影響 (n=6)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01;Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

表2 女貞子對氧化應(yīng)激水平的影響 (n=3)

Contrast to model group，*P<0.05；**P<0.01。Contrast to normal group，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

4 討論

PC12細(xì)胞來自于Rattus norvegicus(褐家鼠)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤) ，經(jīng)NGF誘導(dǎo)分化后，所合成的酶類、表達(dá)的受體以及合成的神經(jīng)遞質(zhì)很接近中腦DA能神經(jīng)元[4-5]。因此PC12細(xì)胞被廣泛用作DA能神經(jīng)元體外研究，特別是用于神經(jīng)變性病如PD發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制的研究。MPTP對中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元有選擇性破壞作用[6]，MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶離子)是MPTP的活性代謝產(chǎn)物，是線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的抑制劑，可導(dǎo)致線粒體ATP 的缺失和膜電位的喪失，從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體功能障礙和氧自由基生成增加，造成多巴胺神經(jīng)元損傷[7]。研究表明，氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致一些氧化損傷標(biāo)記物質(zhì)明顯增多，如MDA[8]。MDA和LDH含量增高，說明多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷程度升高。SOD活性降低，導(dǎo)致自由基量增多。自由基另一個來源為大腦黑質(zhì)病變，一氧化氮合成酶表達(dá)增加，從而導(dǎo)致一氧化氮(NO)和過氧硝酸鹽自由基水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞受損。

本實驗采用將女貞子提取物、MPP+與PC12細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，考察不同提取物對PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性及氧化應(yīng)激作用的影響。實驗結(jié)果表明女貞子水提物及70%醇提物均能顯著性提高細(xì)胞存活率，且其作用與濃度有密切關(guān)系。另外，女貞子水提物能夠顯著降低SOD抑制率，減少MDA、NO及LDH含量，說明其具有抗氧化應(yīng)激作用。由此推斷，女貞子抗PD作用可能是通過抗氧化應(yīng)激而實現(xiàn)的。

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(責(zé)任編輯：姜付平)

Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress induced by MPP+in PC12 cells

Xu Xijuan，Yang Zhonglin*

(China Pharmaceutical University,State Key laboratory of Natural Products and Functions,Nanjing 210009,China)

Objective:To evaluate the effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress in vitro. Methods:PC12 cells induced by MPP+was used as the vitro model of parkinson disease,while adding 70% ethanol extract and aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of different concentrations. Cell vibility was determined by MTT methods.Effect of Fructus Ligustri Lucidi on oxidative stress was tested by kits of SOD,NO,MDA and LDH.Results:Contrast to normal group,cell viability of model group dropped significantly,and inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH of model group significantly raised.Compared with model group, aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi of 1mg/mL increased the cell vibility markedly,and lowered inhibition rate of SOD, content of MDA, content of NO and level of LDH significantly.Conclusion:It implys that aqueous extract of Fructus Ligustri Lucidi can protect PC12 cells from oxidative stress damage.

Fructus Ligustri Lucidi;PC12 Cells; MPP+;oxidative stress damage.

2014-03-11

徐希娟(1989-)，女，中國藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向為中藥制劑學(xué)。

楊中林(1950-)，女，中國藥科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制與中藥制劑。

R285

A

1673-2197(2014)11-0006-03