苯酚-硫酸法測定益肺通絡顆粒水提液總多糖含量

譚喜平，夏新華*，羅純清，黃 莉, 顏 紅，曾建國，劉艷科

(1.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫院，湖南 長沙 410004)

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苯酚-硫酸法測定益肺通絡顆粒水提液總多糖含量

譚喜平1，夏新華1*，羅純清1，黃 莉1, 顏 紅1，曾建國2，劉艷科2

(1.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫院，湖南 長沙 410004)

目的：建立益肺通絡顆粒水提液總多糖的含量測定方法。方法：以葡萄糖為對照品，通過單因素試驗，優選苯酚-硫酸法測定總多糖的最佳顯色條件。結果：最佳顯色條件為：加 5%苯酚1.0mL,濃硫酸6.0mL,在100℃的條件下反應20min，冰水中冷卻至室溫。葡萄糖質量在16.6～124μg范圍內與吸光度呈良好線性關系(r=0.999 1)，平均回收率為100.6%,RSD為2.5%。結論：該法快速準確、穩定方便，可用于益肺通絡顆粒工藝研究中總多糖的含量測定。

益肺通絡顆粒；苯酚-硫酸法；總多糖；含量測定

多糖是由糖苷鍵結合、超過10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，在自然界分布極廣，具有增強機體免疫功能、抗菌、抗肝炎等方面的作用[1-2]。益肺通絡顆粒是國家“十一五”科技重大專項中醫藥治療肺結核臨床科研基地建設中的自擬處方，由黃精、白及等11味藥組成，常與抗結核西藥聯合治療肺結核，具有益氣養陰、化瘀通絡、去腐生肌之功效，其中黃精、白及為處方中的君藥，主要活性成分為黃精多糖、白及多糖，具有抗菌、增強機體免疫功能作用[3-4]，為處方中的主要活性成分。本研究擬采用苯酚-硫酸法建立該處方總多糖的含量測定方法[5-7]，以加強該制劑的工藝研究與質量控制，為進一步深入研究奠定基礎。

目前，多糖的含量測定方法主要有比色法、滴定法、色譜法、毛細管電泳法(HPCE)等[1，8]。滴定法受溫度和滴定速度的影響較大，且不能排除還原糖的干擾；色譜法(主要有薄層掃描法、HPLC法、GC法)雖然簡便、快捷、準確，但需多糖標準品和特定酶，應用受限制[9]；HPCE主要用于蛋白質、多肽等大分子物質的分析，在糖分析中的應用較少；而比色法(應用最為廣泛的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)雖干擾因素多、重現性較差，但操作簡單，易于快速測定，兩種方法對比，以苯酚-硫酸法較為穩定，為多糖較為理想的含量測定方法[10]。本研究通過采用單因素試驗，對苯酚-硫酸法顯色條件進行優化，為該處方中多糖的含量測定方法的建立提供實驗依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

黃精、白及等11味藥材(均購自湖南省三湘中藥飲片有限公司)；D-無水葡萄糖(批號：110833-201205，供含量測定用，含量以 99.5%計，由中國食品藥品檢定研究院提供)；無水乙醇(湖南匯虹試劑有限公司)。

1.2 儀器與設備

UV1102紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)；電子分析天平(AY120，Shimadzu 0.1mg～120g)，80-1型電動離心機(城西曉陰電子儀器廠)，旋轉蒸發器RE-52(上海亞榮生化儀器廠)；98-1C型數字控溫電熱套(天津市斯特儀器有限公司)，SHZ-Ⅲ型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；10mL具塞刻度試管。

2 方法與結果

2.1 復方水提液制備

稱取黃精、白及等11味藥(一個處方量165g)，加熱回流提取2次，第1次加10倍量水，回流提取2h；第2次加8倍量水，回流提取1.5h，過濾，合并2次提取的藥液，減壓濃縮，定容至1 000mL，備用。

2.2 含測用溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取置105 ℃條件下干燥恒重的葡萄糖對照品0.082 9g，加水制成葡萄糖含量為0.082 9mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密移取供試品藥液2mL置離心管中，加無水乙醇8mL，搖勻，3 000r/s 離心15min，棄去上清液，沉淀物加80%的乙醇洗滌2次，8mL/次(每次離心10min)，揮干乙醇后，沉淀加蒸餾水溶解，定容至100mL，精密量取上述稀釋液10mL，加蒸餾水定容至25mL，即得。

2.2.3 不同濃度苯酚溶液制備 分別精密量取苯酚2、3、4、5、6、7g，置100mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 總多糖含量測定

2.3.1 顯色條件確立

(1)檢測波長確定。精密吸取對照品溶液0.8mL,供試品溶液2mL，置有刻度的具塞試管中，加水定容至2mL，加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，加入濃硫酸5.0mL(移液管垂直懸于試管口，快速加入)，搖勻，沸水中反應20min，取出，迅速置冰水中冷卻至室溫。以相應的試劑作空白對照，在波長400～800nm范圍內進行掃描。結果顯示，對照品在489.6nm處有最大吸收，供試品在488.6nm處有最大吸收，空白對照在此無吸收，故本試驗選擇489nm作為測定波長,見圖1。

圖1 葡萄糖對照品溶液(A)與供試品溶液(B)可見吸收光譜

(2)顯色劑苯酚不同濃度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL置于有刻度的具塞試管中，分別加入2%、3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，搖勻，置于沸水浴中20min，取出，迅速至冰水中放至室溫，并加水定容至9mL。平行制備3份，以蒸餾水代替糖溶液，以同樣的方法制備空白對照品，在489nm 處測定吸光度。結果顯示，對照品溶液、供試品溶液的吸光度值均在苯酚的濃度為5%時最大(分別為：0.339±0.014、0.348±0.09)，故本試驗選擇濃度為5%的苯酚,見圖2。

圖2 5%苯酚用量考察

(3)顯色劑硫酸用量考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法分別加入濃硫酸3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL顯色，489nm處測定吸光度。結果顯示：隨著濃硫酸加入量的遞增，供試品(最大值：0.489±0.014)與對照品(最大值：0.465±0.014)的吸光度也呈現遞增趨勢，故本研究選擇濃硫酸的用量為6mL。見圖3。

圖3 濃硫酸加入量考察

(4)反應溫度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同苯酚濃度考察中方法，分別置于0、20、40、60、80、100℃不同溫度條件下顯色，在489nm處測定吸光度。結果顯示，對照品在反應溫度為100℃時有最大吸光值(0.471±0.012)，供試品在反應溫度為80℃時有最大吸收值(0.487±0.015)，因供試品在反應溫度為80℃、100℃時的吸光值相差甚小，故本試驗選擇100℃作為最佳反應溫度，見圖4。

圖4 反應溫度考察

(5)反應時間考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法，分別置沸水浴中反應10、15、20、25、30、35min，于489nm處測定吸光度，結果顯示，反應時間為20min時，吸光度值均最大(分別為0.468±0.012，0.501±0.018)，故本試驗選擇20min作為最佳反應時間，見圖5。

圖5 反應時間考察

(6)冷卻條件考察。精密吸取對照品溶液1.0mL、供試品溶液2mL，同“苯酚濃度考察”中方法顯色，分別置于冰水、常溫水中冷卻至室溫，以蒸餾水代替糖溶液以同樣的方法制備空白對照，在489nm處測定吸光度，結果顯示，冰水中冷卻時，對照品吸光值(0.475±0.014)、供試品吸光值(0.495±0.019)均優于常溫水冷卻，故本試驗選擇在冰水中迅速冷卻的方法，見圖6。

圖6 冷卻條件考察

(7)最佳顯色條件驗證。精密吸取對照品溶液1.0mL，供試品溶液2mL，置有刻度的具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.0mL，搖勻，置沸水浴中反應20min，取出，迅速至冰水中放冷至室溫，分別平行制備3份，以蒸餾水代替糖溶液，以同樣的方法制備空白對照，在489nm處測定吸光度，結果顯示，在最佳顯色條件下制備的溶液中，對照品溶液吸光度的平均值為(0.475±0.023)，供試品溶液吸光度的平均值為(0.496±0.016)。

2.3.2 方法學考察

(1)標準曲線及線性范圍。分別精密量取0.0829mg/mL的對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5mL置于有刻度的具塞試管中，按“最佳顯色條件驗證”項條件顯色，用蒸餾水以同樣方法作空白參比，在489nm處測定吸光度(Abs)。結果顯示葡萄糖在16.6～124μg范圍內與吸光度呈良好線性關系，R2=0.9991，見圖7。

圖7 葡萄糖對照品標準曲線

(2)精密度考察。精密吸取對照品溶液1.0mL分別置編號為6支有刻度的具塞試管中，按“最佳顯色條件驗證”項下方法顯色，在489nm處測定吸光度，代入回歸方程中計算，所得RSD值為2.48%(n=6)，表明該儀器重現性良好。

(3)穩定性試驗。精密量取同一供試品溶液2mL，按“最佳顯色條件驗證”項下的方法顯色，在顯色體系反應完全后，分別在0、10、20、30、45、60min時，于489nm處測定吸光度。結果RSD值為1.06%(n=6)，表明供試品在1h內吸光度基本不變，具有良好穩定性。

(4)重復性試驗。精密量取供試藥液2mL，按供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液，分別從中精密量取2mL，按“最佳顯色條件驗證”項下方法顯色，于489nm處測定吸光度，代入回歸方程中計算，得2mL供試液總多糖的平均含量為89.361μg，RSD值為1.79%(n=6)，表明該供試品重復性良好。

(5)加樣回收試驗。精密量取同一供試品溶液1mL，加對照品溶液1mL，按“最佳顯色條件驗證”項下的方法顯色，平行制備6份，于489nm處測定吸光度，計算加樣回收率，結果如表1所示，加樣回收率較高，符合含量測定要求。

表1 回收率試驗結果

(6)樣品含量測定。稱取黃精、白及等11味藥(一個處方量165g)，按“2.1”項下方法平行制備3份供試品藥液。再分別精密量取3份供試品溶液2mL，按“最佳顯色條件驗證”項下方法顯色，于489nm處分別測定吸光度，代入回歸方程計算，結果益肺通絡顆粒工藝研究中，一個處方量提取液總多糖的含量為(5.632±0.021)g。

3 討論

本試驗在優化苯酚-硫酸法顯色條件過程中，將對照品溶液和供試品溶液在不同顯色條件下的測定結果進行綜合分析，使優選的顯色條件更有說服力。苯酚-硫酸法是在碳水化合物中廣泛應用的一種方法，是測定多糖的常用方法[11]。本研究選用80%乙醇除去樣品中眾多單糖、低聚糖等干擾成分,再用去離子水提取樣品中所含的多糖類成分，然后采用苯酚-硫酸法測定益肺通絡顆粒處方提取液的多糖含量，多糖在濃硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛生物，與苯酚縮合生成橙黃色化合物，在489nm條件下有特征吸收，一定范圍內的葡萄糖濃度與其吸光度呈線性關系。該方法具有快速簡便、穩定可靠等特點，可作為益肺通絡顆粒工藝研究中總多糖含量測定的參考依據。

實驗過程中發現，苯酚-硫酸法顯色反應的操作繁多，試劑的添加、反應時間和溫度的控制都會造成實驗結果的誤差，故在分析檢驗操作時應注意：①苯酚溶液應現配現用，且使用前應充分搖勻，將其中的大量微小氣泡排除;②樣品顯色時，加入苯酚后應迅速搖勻；加入硫酸時，應將滴管懸于試管口，迅速加入，搖勻；冰水中冷卻2～3min，應立即置紫外分光光度計下測量；③應嚴格按照實驗室操作規范，選用準確度高的量器，減少誤差，使測量結果更加可靠。

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(責任編輯：宋勇剛)

Determination of Total Polysaccharides in Aqueous Extracts of Yifei Tongluo Granules by Phenol-Sulfuric Acid Method

Tan Xiping1,Xia Xinhua1*,Luo Chunqing1,Huang Li1,Zeng Jianguo2，Liu Yanke2

(1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208，China；2.Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China)

Objective:To establish the content determination method of total polysaccharides in aqueous extracts of Yifei Tongluo Granules.Methods:With grape sugar as reference substance，the best coloration conditions of phenol-sulfuric acid method for assaying total polysaccharides were optimized by single factor test.Results:The best coloration conditions were as follows: adding 1.0mL of 5% phenol and 6.0mL of sulfuric acid，reacting at 100℃ for 20min, and then cooling to room temperature in ice water. The mass of glucose had a good linear relationship with absorbance at the range of 16.6μg～124μg(r=0.999 1)，and the average recovery was 100.6%，RSD 2.5%.Conclusion:The method is fast，accurate，stable and convenient，which can be available for determination for total polysaccharide in the precess studies of Yifei Tongluo Granules.

Yifei Tongluo Granules；Phenol-sulfuric Acid Method; Total Polysaccharides；Content Determination

2014-05-09

國家科技重大專項“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”子課題(2013ZX10005004-003-001)

譚喜平(1989-)，女，湖南中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥新制劑及制劑質量標準研究。

夏新華(1962-)，男，博士，湖南中醫藥大學教授，博士生導師，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術及制劑質量標準研究。E-mail：xiaxinhua001@163.com。

R284.2

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1673-2197(2014)17-0024-03