活性炭纖維固定化菌對微囊藻毒素MC-LR的去除研究

袁 媛,吳 涓,李玉成,王 寧 (安徽大學資源與環境工程學院, 安徽 合肥 230601)

活性炭纖維固定化菌對微囊藻毒素MC-LR的去除研究

袁 媛,吳 涓,李玉成*,王 寧 (安徽大學資源與環境工程學院, 安徽 合肥 230601)

研究了藻藍蛋白提取過程中微囊藻毒素MC-LR的釋放分布規律,并用活性炭纖維對一株微囊藻毒素降解菌株進行了固定化,考察了不同活性炭纖維預處理方法、活性炭纖維用量、pH值、溫度以及MC-LR濃度對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響.結果表明,藻藍蛋白提取過程中MC-LR主要分布在超濾濾液中,占MC-LR總含量的81.2%.固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的效率明顯高于非固定化藻毒素降解菌. 藻毒素降解菌用(1+9)鹽酸預處理后的活性炭纖維固定化,其去除效果最佳.MC-LR去除的最適條件為:活性炭纖維用量為10g/L,溫度為35℃, pH值為8.0.固定化藻毒素降解菌對pH值,溫度具有一定的耐受性,能夠在pH5～pH9、10℃～35℃范圍內有效地去除MC-LR.

微囊藻毒素-LR；固定化；活性炭纖維；去除率

近年來,巢湖每年都暴發以銅綠微囊藻為主的“水華”,有時堆積可達數km長,數cm厚,腐敗分解后,發出惡臭,嚴重破壞水體及周圍環境[1].為消除巢湖藍藻污染,將打撈上來的藍藻的資源化利用已成為目前的研究熱點[2-3].

藍藻中含有豐富的藻藍蛋白,藻藍蛋白是一種寶石藍色的天然色素,被廣泛應用于食品、飲料、醫藥、化妝品行業,但是目前國內外主要從淡水養殖的螺旋藻中提取藻藍蛋白,其成本昂貴,從而限制了藻藍蛋白的應用發展[4].目前國內已有從水華藍藻中提取藻藍蛋白的報道,但是尚未進行大規模推廣.同時,由于巢湖爆發的水華藍藻以銅綠微囊藻為主[5],而銅綠微囊藻細胞內含有微囊藻毒素, 其性質穩定,是一種致肝癌毒素,對人體具有極大的危害[6].從藍藻中提取藻藍蛋白必須破壁,藍藻一旦破裂微囊藻毒素就釋放出來,污染藻藍蛋白,殘渣殘液中也含有大量的微囊藻毒素,其任意排放將嚴重污染水體.因此在利用藍藻提取藻藍蛋白的過程中必須將微囊藻毒素去除.

目前微囊藻毒素的去除方法主要有物理方法和化學方法等,而微生物降解技術除了具有降解徹底的特點以外,還具有處理成本低,且更安全有效[7]等優勢.雖然能夠降解微囊藻毒素的微生物已有報道[8],但其研究重點主要集中于高效降解菌的篩選及其特性研究[9],而采用活性炭纖維固定化菌來去除藻毒素的研究尚不多見.

固定化微生物技術因其微生物密度高、處理效率高、穩定性強、耐沖擊負荷等優點,目前在環境領域應用廣泛,將其應用于微囊藻毒素污染水體的治理有著很大的發展潛力和應用前景[10].活性炭纖維具有發達的微孔結構、優異的吸附性能、較高的機械強度和良好的生物相容性,易于微生物的固著[11].因此本文以活性炭纖維為固定化材料,研究固定化藻毒素降解菌對微囊藻毒素MC-LR的去除效果,探討pH值、溫度、MC-LR初始濃度等因素對其去除效率的影響,以期為藻毒素降解菌的應用探索新的途徑.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種:所用菌種為實驗室從巢湖沉積物中分離出的一株藻毒素降解菌,經鑒定為蠟狀芽孢桿菌[12].

活性炭纖維:黏膠基氈狀,比表面積為 1600～1800m2/g.

藻 毒 素 標 準 品 MC-LR(分 子 式 : C49H74N10O12,分子量: 995.2)購自美國 Sigma公司,純度≥95% .

試劑:甲醇、三氟乙酸為色譜純試劑,購自上海星可生化有限公司;氯化鈉、硫酸鎂等為分析純試劑,購自上海中試化工總公司;胰蛋白胨、酵母浸粉等購自北京奧博星生物技術有限公司.

主要儀器:SW-CJ-2D超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);ZHP-160智能恒溫搖床培養箱(上海三發科學儀器有限公司); PHO50A 恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司);CT14RD型高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備有限公司);Waters Alliannce-2695型高效液相色譜儀,配Waters SunFire C18(4.6×250mm)色譜柱.

營養培養基:采用LB培養基,胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g, NaCl 10.0g ,H2O 1000mL.

無機鹽培養基:采用基礎培養基[13],添加提取純化的MCs作為微生物生長的唯一碳源和氮源,其初始pH值為7.5.

1.2 實驗方法

1.2.1 MC-LR的提取純化及檢測 實驗所用藻毒素為藍藻提取藻藍蛋白過程中所釋放的藻毒素,提取純化方法在參考文獻[14]的基礎上略微做了調整,即采用 5%的乙酸溶液取代文獻中的甲醇作為 MCs 的提取劑.

藻藍藍白的提取純化方法及技術路線如下:采集新鮮藻漿,凍融破壁得上清液,上清液加入20%飽和度的硫酸銨鹽析,離心得上清液,上清液加入50%飽和度的硫酸銨鹽析,離心得沉淀,將沉淀復溶于去離子水中,復溶的粗提液通過雙水相萃取得到富含藻藍蛋白的上相,采用超濾除雜的方法提取藻藍蛋白[15].在藻藍蛋白提取過程中,提取檢測各階段廢棄物中以及藻藍蛋白濃縮液中MC-LR的含量.

MC-LR的檢測條件:Waters Alliannce-2695型高效液相色譜儀,DAD二極管陣列檢測器為Waters-2996型,流動相是60%甲醇+40%水,水相中含有 0.05%的三氟乙酸,流速為 1.0mL/min,檢測波長為 238nm,進樣量為 20μL.每個樣品平行測定3次.

1.2.2 活性炭纖維的預處理 將活性炭纖維用去離子水沖洗至無浮渣后放入燒杯中,加入去離子水煮沸 1.0～1.5h,然后分別在去離子水, (1+9)鹽酸, 10%NaOH溶液中浸泡24h,并用去離子水沖洗至中性并瀝干.將其平攤在搪瓷托盤中,用牛皮紙封蓋后放入烘箱,于 140℃中烘 48h,取出并置于干燥密閉容器內待用.

1.2.3 藻毒素降解菌的固定化 將預處理后的活性炭纖維加入裝有 50mL營養培養基的錐形瓶中,于120℃下滅菌20min.接種藻毒素降解菌,于30℃、140r/min下振蕩培養,讓菌體充分固定于活性炭纖維中.固定化完成后,將活性炭纖維用生理鹽水洗滌2次.

1.2.4 掃描電子顯微鏡觀察固定化效果 采用日本日立S-4800掃描式電子顯微鏡觀察固定化前后活性炭纖維表面的微生物生長情況.

1.2.5 藻毒素降解菌的生長曲線測定 在無機鹽培養基中接種藻毒素降解菌,于30℃、140r/min下振蕩培養,置于黑暗處防止光降解.定時取出發酵液,用分光光度計測其在 600nm處的吸光度(OD600).以培養時間為橫坐標、OD600為縱坐標繪制藻毒素降解菌的生長曲線.

1.2.6 MC-LR的分析測定 首先用MC-LR標準品配制濃度分別為 1.0,2.0,4.0, 6.0, 8.0, 10.0mg/L的標準溶液,然后根據高效液相色譜(HPLC)圖上 238nm 波長處的峰面積,建立峰面積與標準溶液濃度之間的一元線性回歸方程.在去除 MC-LR過程中,取樣離心,將上清液過0.45um濾膜,收集濾液,在 HPLC上測定其峰面積,代入回歸方程即可計算MC-LR的濃度.

為減少操作過程中產程的系統誤差,提高分析精確度,MC-LR的檢測采用內標法.標準曲線的相關系數＞0.999.本研究得到的加標回收率為91.5%～105.6%,相對標準偏差為 2.38%～4.31%,最小檢測限小于 1μg/L,表明本試驗具有較高的準確度.

1.2.7 固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的影響因素研究 在 150mL三角瓶中加入 50mL無機鹽培養基并滅菌,將固定化的藻毒素降解菌接種至上述培養基中,在 30℃、140r/min 條件下培養,置于黑暗處防止光降解.每隔 24h 取樣測定培養液中 MC-LR 的濃度.MC-LR的去除率可用式(1)求得.

D(%) = (A0-A)/ A0×100% (1)式(1)中: A0為空白培養液中 MC-LR 的初始濃度; A為接種固定化藻毒素降解菌并培養一定時間后的培養液中 MC-LR 的濃度;D為MC-LR的去除率,%.

分別考察不同活性炭纖維用量、不同 pH值、不同 MC-LR初始濃度及不同溫度條件下固定化藻毒素降解菌對MC-LR去除率的影響.在相同條件下,以加入非固定化藻毒素降解菌作為對照.為簡化表述,下文將固定化藻毒素降解菌稱為固定化菌,將非固定化的藻毒素降解菌稱為游離菌.

采用 PASW Statistics 18.0 統計軟件對實驗結果進行方差分析.

2 結果與討論

2.1 藻藍蛋白提取過程中藻毒素含量的測定

在藻藍蛋白提取過程中,提取檢測各階段廢棄物中以及藻藍蛋白濃縮液中藻毒素的含量,其中藻藍蛋白濃縮液中未檢測到 MC-LR,各階段廢棄物中MC-LR含量分布情況如圖1所示.由圖1可見,MC-LR主要分布于超濾濾液中,其含量達到總含量的81.23%.在硫酸銨鹽析及雙水相萃取階段,MC-LR并不能有效的從藻藍蛋白中分離出來,這對藻藍蛋白的提取純化及 MC-LR的去除具有一定的指導意義,即可以在藻毒素集中的提取階段進行重點治理,其他階段可采取一般的水處理工藝.

圖1 MC-LR在藻藍蛋白提取過程中的分布Fig.1 Distribution of MC-LR in the phycocyanin extraction

2.2 藻毒素降解菌的生長曲線

圖2 藻毒素降解菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of microcystin-degrading strain

由圖 2可見,藻毒素降解菌在營養培養基中的生長延滯期為10h左右, 在此期間菌體為適應新環境而表現出生長遲緩;培養10h后,菌體進入對數生長期,在此期間菌體數量呈指數倍增,48h時已達到生長高峰,72h后進入生長穩定期.因此,將藻毒素降解菌的培養時間和固定化培養時間均選為48h.

2.3 活性炭纖維預處理

圖3表明,采用(1+9)鹽酸預處理的活性炭纖維,其固定化菌對 MC-LR的去除率最高,達到89.2%,比不經任何預處理的活性炭纖維固定化菌高出 36.0%.實驗同時也證明了活性炭纖維在使用前進行預處理的必要性.由于活性炭纖維表面是微孔結構,極易吸附空氣中的雜質,從而影響微生物的固定[15],所以在使用前需要進行預處理,經過嚴格的處理后,活性炭纖維上的雜質將會明顯降低,為下一步的實驗創造有利條件[16].因此,研究過程中選用(1+9)鹽酸預處理的活性炭纖維作為實驗材料.

圖3 活性炭纖維預處理方法對固定化藻毒素去除菌去除MC-LR的影響Fig.3 Effects of the activated carbon fiber pretreatment methods on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain縱條表示標準偏差(N = 3),下同

2.4 掃描電子顯微鏡觀察固定化效果

由圖4可知,活性炭纖維呈束狀纖維,固定化前,其表面光滑,固定化后,微生物主要附著在活性炭纖維束的表面,有利于其生長繁殖,既可以充分發揮活性炭纖維的吸附性能,又可以充分發揮微生物的生物降解能力[17].活性炭纖維具有良好的生物相容性,它作為微生物的載體是可行的.

圖4 活性炭纖維表面的電鏡照片Fig.4 SEM images of the surface of activated carbon fibera.固定化前的活性炭纖維, b.固定化后的活性炭纖維

2.5 固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR 的影響因素研究

2.5.1 活性炭纖維用量的影響 在藻毒素降解菌的固定化培養過程中,使營養培養基中活性炭纖維的濃度分別為2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0g/L.培養 48h后將固定化菌體接種于無機鹽培養基中,培養基中MC-LR的初始濃度為6.8mg/L, pH值為8時,溫度為35℃,5d后取樣測定藻毒素去除率,結果如圖5所示.

由圖 5可知,活性炭纖維用量并不是越多越好,當用量為2.0～10.0g/L時, MC-LR的去除率隨著活性炭纖維用量的增加而上升(77.3%～92.9%);當用量多于10.0g/L后, MC-LR的去除率開始呈下降趨勢.藻毒素降解菌的固定化過程主要是使菌體細胞附著于活性炭纖維上,所附著的菌體量與活性炭纖維的用量成正比.雖然菌體細胞數量的增長在一定程度上會提高藻毒素去除率,但是菌體細胞的過量生長會導致營養物質短缺,且菌體細胞密度過大不利于微生物的生長,會導致細胞的新陳代謝與生長速度減緩,從而影響藻毒素的去除.由此可確定藻毒素降解菌固定化時的最佳活性炭纖維用量為10g/L.

圖5 活性炭纖維用量對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響Fig.5 Effects of dosage of activated carbon fiber on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

2.5.2 pH值的影響 控制活性炭纖維用量為10g/L,無機鹽培養基中 MC-LR的初始濃度為6.8mg/L,分別將培養基的 pH 值調節為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,接種固定化菌,考察環境 pH 值對固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的影響,結果如圖 6所示.反應 5d后固定化菌和游離菌去除MC-LR的效率對比見圖7.

圖6 pH值對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響Fig.6 Effects of pH on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

由圖6可知,在反應初期,MC-LR的去除率并不高,但隨著反應時間的延長,不同 pH值條件下去除率顯著增加(P<0.05).在反應前3d內平均去除效率達到 77.2%,隨后去除率的增加趨于緩慢.圖7表明,當pH值為5.0～9.0時,固定化菌和游離菌對MC-LR的去除率分別為87.2%～90.9%和10.6%～59.6%,可見固定化菌的藻毒素去除率明顯高于游離菌.在pH5.0～9.0范圍內,固定化菌對MC-LR的去除率保持在較高水平,并在pH8.0時達到最大,為90.9%.而游離菌對MC-LR的去除率在 pH5.0～8.0范圍內則呈現明顯的增加趨勢,且在pH8.0時去除率也達到最大,為59.6%.pH值繼續增大,MC-LR的去除率又開始下降.微生物生長環境的 pH值對其生長產生很大的影響,一方面是由于pH值會使細胞膜上的電荷發生變化,從而使細胞膜的通透性發生改變,部分離子滲透作用加強或減弱,從而擾亂了細胞對物質交換過程的控制;另一方面是由于培養基中某些有機物質的離子化狀態和營養元素會因環境pH值的變化而改變其存在狀態,從而使細胞吸收和代謝營養物質的途徑出現障礙,而最重要的是細菌分泌的胞內或胞外酶活性都對環境pH值有很大的敏感性[18].本實驗表明,固定化藻毒素降解菌對環境pH值的變化有更好的耐受性,可以承受pH值的較大變化而保持較高的MC-LR去除率.

圖7 不同pH值條件下固定化菌與游離菌對MC-LR的去除Fig.7 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different pH values

2.5.3 溫度的影響 在活性炭纖維用量為10g/L,無機鹽培養基中 MC-LR的初始濃度為6.8mg/L, pH值為 8時,設置溫度分別為 10,15, 20,25,30,35℃,接種固定化菌,考察溫度對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響,結果見圖8.反應5d后固定化菌和游離菌去除MC-LR的效率對比見圖9.

圖8 溫度對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響Fig.8 Effects of temperature on the removal of MC-LR by immobilized microcystin-degrading strain

圖9 不同溫度條件下固定化菌與游離菌對MC-LR的去除Fig.9 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different temperature

由圖 8可知,隨著反應時間的延長,MC-LR的去除率在前3d顯著增加(P<0.01),平均去除率可達到72.9%,但隨后MC-LR去除率的增加趨于平緩.溫度對該菌的去除效果具有顯著的影響(P<0.05),隨溫度的升高,去除率略有上升.從圖 9可知,游離菌在 10℃～35℃的范圍內,對 MC-LR的去除率為10.2%～60.6%,波動較大;而固定化藻毒素降解菌在相同條件下對 MC-LR的去除率則為 79.1%～92.7%,普遍較高.這一結果表明,固定化藻毒素降解菌受溫度的影響較小,尤其是在低溫條件下,固定化菌的藻毒素去除活性依然較高.當溫度為 35℃時,固定化菌和游離菌對 MC-LR的去除率均達到最高值,分別為 92.7%和 60.6%,固定化菌的藻毒素去除率明顯高于游離菌.因此,固定化藻毒素降解菌對溫度具有更好的耐受性. 2.5.4 MC-LR初始濃度的影響 在活性炭纖維用量為10g/L,溫度為35℃,pH值為8時,考察不同MC-LR初始濃度對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響,結果見圖10.反應5d后固定化菌和游離菌去除MC-LR的效率對比,結果見圖11.

圖10 MC-LR初始濃度對固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影響Fig.10 Effects of initial MC-LR concentrations on the removal of MC-LR by immobilized microcystindegrading strain

圖11 不同MC-LR初始濃度下固定化菌與游離菌對MC-LR的去除Fig.11 The removal of MC-LR by immobilized strain and free strain under different initial MC-LR concentrations

由圖10可知,隨著反應時間的延長,MC-LR的去除率在前3d顯著增加(P<0.01),平均去除率達到 77.9%,隨后去除率的增加變得不顯著.由圖11可見,當MC-LR初始濃度為1.7～13.6mg/L時,固定化菌和游離菌的藻毒素去除率分別為78.8%～92.6%和 22.4%～55.4%,且固定化菌和游離菌的藻毒素去除率均隨著藻毒素初始濃度的增大而呈上升趨勢;當 MC-LR初始濃度達到27.2mg/L時, 固定化菌的藻毒素去除率略有下降,而游離菌的藻毒素去除率則出現明顯下降.當MC-LR初始濃度較低時,細胞可利用的碳氮源較少,菌株生長緩慢,藻毒素降解菌的生長繁殖受到抑制,因此其去除率較低.隨著MC-LR初始濃度的增大,可利用的碳氮源增多,細胞大幅生長,去除率同時也增大.但是 MC-LR初始濃度繼續增大時,可能對菌株的生長有毒害作用,從而抑制了藻毒素降解菌的生長,導致 MC-LR降解率的下降.而固定化菌由于菌密度較大,且活性炭纖維具有較強的物理吸附能力,能將藻毒素吸附在活性炭纖維上,為藻毒素降解菌充分利用藻毒素創造了條件.因此在所實驗的 MC-LR初始濃度范圍內,固定化菌對 MC-LR的去除率均高于游離菌.由此可見,固定化藻毒素降解菌可以在較寬的MC-LR濃度范圍內較好地去除MC-LR.

3 結論

3.1 在藻藍蛋白的提取純化過程中 MC-LR主要分布于超濾濾液中,含量達到總含量的81.23%,這對藻藍蛋白的提取純化及 MC-LR的去除具有一定的理論指導意義.

3.2 采用(1+9)鹽酸預處理的活性炭纖維,其固定化效果最佳,對MC-LR的去除率達到89.2%,比不經任何預處理的活性炭纖維固定化菌高出 36.0%.表明活性炭纖維在使用前進行預處理是必要的.

3.3 將活性炭纖維作為固定化載體,將藻毒素降解菌固定化,固定化載體上的菌體密度大,在不同的溫度、pH、MC-LR初始濃度條件下,固定化菌的藻毒素去除率均高于游離菌.

3.4 將活性炭纖維作為藻毒素降解菌的固定化載體,既有很好的生物相容性,又能降低環境中的不利因素對藻毒素降解菌降解活性的抑制.在本實驗中,最適活性炭用量為10.0g/L,最適pH值為8.0,最適溫度為35℃.

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Removal of microcystin-LR by a microcystin-degrading strain immobilized by activated carbon fiber.

YUAN Yuan,

WU Juan, LI Yu-cheng*, WANG Ning (School of Resources and Environmental Engineering, Anhui University, Hefei 230601, China). China Environmental Science,2014,34(2)：403～409

Distribution of MC-LR during the extraction of phycocyanin was studied. A microcystin-degrading strain was immobilized by activated carbon fiber (ACF), and the effect factors, such as the pretreatment methods of activated carbon fiber, dosage of activated carbon fiber, pH value, temperature and the initial concentration of MC-LR were investigated. The results showed that 81.2% of MC-LR existed in the ultrafiltrate during the phycocyanin extraction. The immobilized strain presented significantly better performance in MC-LR removal than the non-immobilized strain. The performance of ACF which was pretreated with (1+9) HCl was much better than others. The optimum removal conditions were as follows: dosage of activated carbon fiber was 10g/L, the temperature was 35℃, the pH value was 8.0, and the initial concentration of MC-LR was 13.6mg/L. Therefore, immobilized strain showed a certain tolerance towards the pH value and the temperature. And MC-LR could be removed effectively in the range of pH5 to pH9, 10℃～35℃.

microcystin-LR；immobilization；activated carbon fiber；removal rate

X703.5

：A

：1000-6923(2014)02-0403-07

袁 媛(1988-),女,河北石家莊人,安徽大學資源與環境工程學院碩士研究生,研究方向為水污染治理.

2013-06-10

國家自然科學基金項目(40972092,41172121);安徽高校省級科學研究項目(KJ2012A006)

* 責任作者, 教授, li-yucheng@163.com