蛹蟲草液體發酵培養基的優化

葉晶晶，曹寧寧，劉剛，吳建梅，殷浩，胡祚忠，張劍飛

（1.四川省農業科學院蠶業研究所，四川南充 637000；2.四川省南充蠶種場，四川南充 637000）

蛹蟲草液體發酵培養基的優化

葉晶晶1，曹寧寧2，劉剛1，吳建梅1，殷浩1，胡祚忠1，張劍飛1

（1.四川省農業科學院蠶業研究所，四川南充 637000；2.四川省南充蠶種場，四川南充 637000）

采用統計學方法對1株蛹蟲草Cordyceps militarisDY-1菌株進行液體發酵配方優化，以期得到適合蛹蟲草生長的最佳培養基配方。以菌絲體干質量濃度為指標，首先采用單次單因子方法篩選出培養基中的最優碳源、氮源及無機鹽和正交試驗方法得出最佳的碳氮比（C/N）；然后采用Plackett-Burman（BP）設計篩選出影響菌絲體干質量濃度的關鍵因素，通過中心組合和響應面法確定關鍵因素的最佳濃度，從而得到出菌株DY-1的液體發酵最佳培養基配方為：葡萄糖16.40 g·L-1，酵母浸膏粉5.00 g·L-1，硝酸鉀1.00 g·L-1，硫酸鎂0.20 g·L-1，磷酸二氫鉀1.80 g·L-1，硫酸亞鐵0.02 g·L-1。經驗證，菌絲體干質量濃度為32.11 g·L-1，與模型的預測值基本一致。運用最佳培養基配方進行液體發酵，菌絲體干質量濃度較基礎培養基提高了4.12倍。圖3表9參28

蛹蟲草；菌絲體干質量濃度；PB設計；響應面法；中心組合設計

蛹蟲草Cordyceps militaris，又稱為北蟲草，北冬蟲夏草，隸屬于真菌界的子囊菌門Ascomycota肉座菌目Hypocreales麥角菌科Clavicipitaceae，是世界性廣布種[1]。其所含的蟲草素比天然冬蟲夏草Cordyceps sinensis還要高，藥效與天然冬蟲夏草相似[2]，具有明顯的抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老等作用[3-5]。人工栽培蛹蟲草子實體生產周期長，產量有限，國內外學者一直致力于蛹蟲草液體發酵培養的研究[6-7]。研究表明，采用液體培養的蟲草菌絲體，其所含的主要成分與天然子實體十分接近[8]，且具有培養條件易控制、產量高、生長周期短且活性物質易于提取等特點，有望成為野生蟲草的替代品[9-11]。因此，液體發酵生產蛹蟲草菌絲體不僅具有重要的應用價值，而且對保護有限的野生蟲草資源也具有重要的意義。近年來，蛹蟲草液體培養的研究取得了很大進展，但由于蛹蟲草菌株及培養基配方等原因，使培養產物有諸多差異［12-13]。目前，對蛹蟲草液體培養基配方的優化主要從單因素試驗和正交試驗兩方面［14-19]，對配方的優化方法的研究還不夠深入，不能確定各因素之間的協同關系。本研究分別采用單因素試驗、正交試驗、Plackett-Burman（BP）設計、中心組合試驗及響應面法系統全面地對蛹蟲草液體培養的培養基配方進行優化，以菌絲體干質量濃度為響應值，采用多元二次回歸擬合方程，通過求偏導獲得主要影響因子的最佳濃度配比，篩選出最佳的培養基配方。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

蛹蟲草菌株DY-1由四川省農業科學院蠶業研究所養蠶法研究室分離并保存。

所用試劑硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硝酸鉀、氯化鈉等均為分析純，購自國藥集團藥業股份有限公司，試驗用水為自制雙蒸水和去離子水。

BP1211S 1/10J電子天平（德國賽多利斯有限公司），ZK-82A型真空干燥箱（上虞市宏興機械儀器制造有限公司），KQ-600型超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司），DHZ-DA恒溫振蕩培養箱（江蘇太倉儀器設備有限公司），TG16-WS臺式離心機（湖南滬康離心機有限公司）；YX400高壓蒸汽滅菌鍋（上海安銳自動化儀表有限公司）。

1.2 培養基配方

1.2.1 種子液培養基配方土豆200.00 g，葡萄糖20.00 g，蒸餾水1 000.00 mL，自然pH值。121℃滅菌30 min，備用。

1.2.2 基礎培養基配方M1：土豆200.00 g，牛肉膏5.00 g，硫酸鎂1.00 g，磷酸二氫鉀0.60 g，硫酸銨1.00 g，碳酸鈣3.00 g，蒸餾水1 000.00 mL；M2：酵母粉5.00 g，蛋白胨10.00 g，氯化鈉10.00 g，蒸餾水1 000.00 mL；M3：葡萄糖20.00 g，蛋白胨10.00 g，硫酸鎂1.50 g，磷酸二氫鉀1.50 g，蒸餾水1 000.00 mL；M4：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，蔗糖10.00 g，酵母膏1.00 g，蒸餾水1 000.00 mL；M5：葡萄糖16.00 g，可溶性淀粉2.50 g，蛋白胨10.00 g，豆餅粉26.00 g，玉米漿1.00 g，氯化鈉7.50 g，硫酸銨4.00 g，蒸餾水1 000.00 mL。自然pH值。培養基用聚乙烯膜封口，121℃滅菌30 min，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化方法從固體斜面培養基上取1.0 cm2的菌絲塊2塊，接種到已滅菌的裝有400.00 mL種子培養基的1 000.00 mL三角瓶中，22℃，180 r·min-1，振蕩培養72 h，備用。

1.3.2 接種及培養方法將10.00 mL活化的菌株孢子懸液接種于已滅菌的裝有100.00 mL基礎培養基的500.00 mL三角瓶中（孢子濃度用血球計數板測定為2.0×106個·mL-1），22℃，180 r·min-1，振蕩培養5 d，重復2次·處理-1。

1.3.3 菌絲體生物量測定方法采用菌絲體干質量法，取發酵液100.00 mL，轉速3 000 r·min-1離心15 min，傾去上清液，菌絲體于80℃烘干至恒量，用分析天平稱量，取2次重復試驗的平均值為菌絲體質量。

1.4 培養基配方優化的方法

1.4.1 基礎培養基的篩選分別采用1.2.2節中的5種基礎培養基對菌株DY-1進行液體發酵，通過測定菌絲體干質量濃度，篩選出干質量濃度最高的培養基配方，在此基礎上進行培養基配方的優化。

1.4.2 單因素試驗所篩選出的基礎培養基中的碳源采用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆、玉米粉，以20.00 g·L-1添加，以不含碳源的培養基為對照，重復2次·處理-1。測定菌絲體干質量濃度，比較不同碳源對菌絲體干質量濃度的影響。有機氮源分別選取蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉、酵母浸膏粉進行單因素分析，基礎培養基以10.00 g·L-1添加；無機氮源分別選取硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨進行單因素分析，基礎培養基以1.00 g·L-1添加；其他方法同1.4.2節。

1.4.3 不同碳氮肥比（C/N）對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響將篩選到的最佳碳源、有機氮源和無機氮源參照正交表L16（45）進行正交試驗設計，其因素與水平的設置見表1，重復2次·處理-1。測定菌絲體干質量濃度，比較不同C/N比對菌絲體干質量濃度的影響。

1.4.4 不同無機鹽對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響本研究首先進行了不同無機鹽對DY-1菌株菌絲干質量濃度的單因素影響試驗，篩選出了對菌絲干質量濃度影響較大的3種無機鹽硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵。本研究對這3種無機鹽，根據正交表L9（34）進行正交試驗設計，其因素與水平的設置見表2，重復2次·處理-1。測定菌絲體干質量濃度，比較不同C/N比對菌絲干質量濃度的影響。

表1 因素與水平的設置Table 1 Arrangement of factors and levels

表2 因素與水平的設置Table 2 Arrangement of factors and levels

1.4.5 Plackett-Burman（BP）試驗設計根據以上試驗結果，選取6個影響顯著的因子進行試驗，其因素水平及編碼見表3。

1.4.6 最陡爬坡試驗利用Minitab 14軟件對試驗數據進行一元線性回歸分析，根據試驗擬合的一次多項式方程找出主要影響因子，并確定最陡爬坡的方向及步長，由此接近最大響應區域[20]。

1.4.7 中心組合試驗在部分因子試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，進行中心組合試驗設計。本階段試驗設計、數據分析及模型的建立是借助于Design Expert 7.0和SAS 9.0輔助完成[21]。

1.5 數據處理

試驗數據采用SAS 9.0數據分析軟件進行統計分析。

表3 Plackett-Burman（PB）試驗設計的因素及其編碼值Table 3 Factors and coded values of PB design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知：M3培養基中菌絲體干質量濃度最高，經SAS 9.0分析，選擇M3培養基作為基礎培養基進行其他因素的篩選。篩選出的最佳碳源、最佳有機氮源和最佳無機氮源分別為葡萄糖、酵母浸膏粉和硝酸鉀。

2.2 不同C/N比對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響結果

以葡萄糖為最佳碳源，酵母浸膏粉、硝酸鉀為最佳有機氮源、無機氮源，進行正交試驗。采用SAS9.0數據分析軟件對正交試驗結果進行方差分析，分析結果見表4。葡萄糖、酵母浸膏粉、硝酸鉀對菌絲體干質量濃度均有極顯著影響。分別分析3種因素結果表明：葡萄糖10.00 g·L-1，酵母浸膏粉5.00 g·L-1，硝酸鉀1.00 g·L-1為最佳的C/N比組合。

2.3 不同無機鹽對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響結果

在悅管家的企業客戶中，國家奧林匹克體育中心、中國政法大學、中國地質大學、中國計量院、漕河涇園區、上實、百聯等單位赫然在列，儼然成為了悅管家優質服務的背書。而企業服務也已經成為悅管家向新的城市復制擴張的先鋒隊。

以4種不同無機鹽對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響進行正交試驗。經SAS 9.0數據分析軟件對其結果進行方差分析，結果見表5。分析結果表明：硫酸鎂、磷酸二氫鉀和硫酸亞鐵對菌絲體干質量濃度的影響均達到顯著水平。分析可知影響菌絲體干質量濃度最高的無機鹽的組合為：硫酸鎂0.20 g·L-1，磷酸二氫鉀1.50 g·L-1，硫酸亞鐵0.02 g·L-1。

2.4 Plackett-Burman（PB）試驗結果

根據上述試驗可知，對蛹蟲草菌絲體具有顯著影響作用的共有以下6個因素：葡萄糖、酵母浸膏粉、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和硫酸亞鐵。采用Minitab軟件進行PB試驗設計，并對試驗結果進行方差分析，得到各因素對菌絲體干質量濃度的影響效果（表6）。由表6可以看出：影響菌絲體干質量濃度的極顯著因素有葡萄糖（P=0.000）和磷酸二氫鉀（P=0.006）。其他因素如酵母浸膏粉（P= 0.099），硝酸鉀（P=0.219），硫酸鎂（P=0.141）和硫酸亞鐵（P=0.632）等對菌絲體干質量濃度的影響均不顯著。對試驗數據進行分析，并擬合一次回歸方程，其模型為：C7=26.3+2.41C1-0.439C2+0.312C3-0.384C4+0.907C5-0.116 C6。（其中：C1代表葡萄糖；C2代表酵母浸膏粉；C3代表硝酸鉀；C4代表硫酸鎂；C5代表磷酸二氫鉀；C6代表硫酸亞鐵；C7代表菌絲體干質量濃度）。該方程的R2（adj）為90.7%，表明該回歸方程擬合良好[21]。

2.5 最陡爬坡試驗結果

根據PB試驗結果，進一步選擇葡萄糖，磷酸二氫鉀這2個顯著因素進行最陡爬坡試驗，當葡萄糖為15.00 g·L-1，磷酸二氫鉀為1.70 g·L-1時，菌絲體干質量濃度最高，為32.00 g·L-1，試驗結果見表7。

根據最陡爬坡試驗結果可知：處理3的菌絲體干質量濃度已接近最大，故選用處理3的培養基作為中心組合試驗的中心點，進行中心組合試驗設計。其因素水平見表8。利用SAS 9.0中的響應面回歸命令對試驗結果數據進行分析，建立以菌絲體干質量濃度為響應面的多元線性回歸模型，并且對模型系數和概率進行統計分析，結果見表9。響應面圖及等高線見圖2。從等高線圖可以直觀的反映出兩變量相互作用的顯著程度，圓形表示2因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖2中等高線呈近似圓形，表明兩因素的交互作用不顯著。中心組合試驗的失擬性分析結果見圖3。從圖3中可以看出試驗數據的擬合度較好，試驗數據的可信度高。由表9擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程（y為菌絲體干質量濃度）：

圖1 不同發酵培養基中菌絲體干質量濃度Figure 1 Dry weight of mycelium in different mediuns

表4 不同C/N對菌株DY-1菌絲體干質量濃度的影響Table 4 Effects of different C/N on mycelium dry weight of strain DY-1

表5 不同無機鹽對菌絲體干質量濃度的影響Table 5 Effect of different inorganic salts on mycelium dry weigh

表6 各因素的主效應Table 6 The main effects of factors

其中：A代表葡萄糖；B代表磷酸二氫鉀；AB代表葡萄糖與磷酸二氫鉀的交互作用項。

表7 最陡爬坡試驗設計及結果Table 7 Experimental designs and results of the steepest accent experiment

模型的可靠性可由方差分析及決定系數來檢驗，P=0.001 4（P＜0.01）說明模型是極顯著的。決定系數R2（adj）=97.44，這表明97.44%的試驗數據可用此模型解釋，因此，回歸方程擬合程度良好。由方程可知：由于二次項系數均為負值，方程代表的拋物面開口向下，因而該方程有極大值點。對方程利用SAS 9.0進行分析，得到模型的極值點（A=0.277；B=0.186），即葡萄糖為16.40 g·L-1，磷酸二氫鉀為1.80 g·L-1時，菌絲體干質量濃度達到最高，預測值達到32.22 g·L-1，實測值（32.11 g·L-1）與預測值基本相符。

表9 中心組合試驗回歸方程方差分析表Table 9ANOVA for the regression equation of central composition design

3 討論

通常優化培養基的方法主要包括單次單因子法和正交試驗設計法。單次單因子試驗是討論一種因素的影響，由于考察因素間經常存在交互作用，所以該方法并非總能獲得最佳的優化條件[22]；而正交試驗不能給出整個區域上因素和響應值之間的一個明確的函數表達式即回歸方程，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最佳組合。因此，國內外不少學者[23-24]通過響應面分析法在培養基優化方面取得了良好效果。

圖2 響應面分析圖Figure 2 Response surface analysis

通過響應面分析法建立各因素與響應值之間的數學模型，可以較直觀看出不同因素之間的交互作用，進行有針對性的調整，減少試驗次數，提高效率，在生產實際中有廣泛的應用價值。在本研究中，通過響應面分析法建立了葡萄糖和磷酸二氫鉀等2個影響顯著的因素和響應值菌絲體生物量之間的數學模型，并通過直觀的等高線圖證實2個影響顯著因素的交互作用不顯著。通過試驗驗證，在響應面優化后所獲得實際值與預測的最大響應值間擬合程度良好，模型的回歸效果顯著，能很好地預測蛹蟲草菌絲的生長狀況，表明中心組合設計和響應面分析法在培養基優化方面的應用具有實際指導作用。優化得到蛹蟲草液體培養的最佳培養基配方為：葡萄糖16.40 g·L-1，酵母浸膏粉5.00 g·L-1，硝酸鉀1.00 g·L-1，硫酸鎂0.20 g·L-1，磷酸二氫鉀1.80 g·L-1，硫酸亞鐵0.02 g·L-1。在此條件下，通過驗證菌絲體生物量達到32.22 g·L-1，比單因素優化提高了1.01倍，較基礎培養基提高了4.12倍；而蔡友華等[25]、周廣麒等[26]及李珺等[27]對蟲草液體發酵培養基優化得到的菌絲體生物量均低于此值。

在所試驗的6種碳源中，葡萄糖最有利于蟲草菌的生長；這與蔡友華等[25]和劉苗苗等[28]的研究一致，而周廣麒等[26]篩選出的蛹蟲草的最佳碳源是蔗糖，這可能與蛹蟲草菌株的性狀不同有關系；在所選的氮源中，酵母浸膏粉和硝酸鉀能很好地促進菌絲體的生長，碳氮源是微生物生長所必須的營養物質，碳氮源的種類不僅影響微生物的生長，還會影響多糖等代謝產物的合成。液體培養的周期比固體培養時間大大縮短，而生物量達到30.00 g·L-1以上，且發酵產生的菌絲體呈白色，味清香，可以加入到面食糕點中，提高營養價值。

利用最陡爬坡試驗及響應面分析法，對解決優化發酵工藝，獲得高產量的蛹蟲草菌絲體的問題，具有十分重要的意義和廣泛的應用前景，同時這種工藝可在其他微生物發酵過程中得到廣泛應用。

圖3 中心組合試驗失擬性分析圖Figure 3 Normal plot of residuals

[1]KIRK P M,CANNON P F,DAVID J C,et al.Dictionary of Fungi[M].9th ed.Wallingford Oxon：CAB International,2001：655-657.

[2]溫魯，尹起范，唐玉玲.蠶蟲草與有關蟲草活性成分檢測比較[J].食品科學，2004，25（8）：155-157.

WEN Lu,YI Qifan,TANG Yuling.Assay and comparison of the effective compositions produced in cordyceps militaris（BombyxMori）[J].Food Sci,2004,25（8）：155-157.

[3]張雪超，王云.蛹蟲草栽培技術[J].吉林林業科技，2009，38（2）：56-57.

ZHANG Xuechao,WANG Yun.Cordyceps cultivation techniques[J].J Jilin For Sci Technol,2009,38（2）：56-57.

[4]李昊，吳百昌，李春蘭.蛹蟲草人工栽培與深度開發[M].北京：科學技術文獻出版社，2008：2-3.

[5]王戰勇，張建東.北冬蟲夏草液體培養基的研究[J].遼寧石油化工大學學報，2004，24（1）：19-25.

WANG Zhanyong,ZHANG Jiandong.Liquid culture medium ofCordyceps militaris[J].J Liaoning Univ Petrole& Chem Technol,2004,24（1）：19-25.

[6]MASUDA M,URABE E,HONDA H,et al.Enhanced production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroomCordyceps militaris[J].Enzyme Microb Technol,2007,40（5）：1199-1201.

[7]周洪波，肖升木，阮承超，等.蛹蟲草液體的深層發酵研究[J].中南大學學報：自然科學版，2006，37（6）：1098-1102.

ZHOU Hongbo,XIAO Shengmu,RUAN Chengchao,et al.Submerged fermentation ofCordyceps militaris[J].J Cent South Univ Sci Technol,2006,37（6）：1098-1102.

[8]張緒璋.北冬蟲夏草的人工培植及其營養成分分析[J].中國食用菌，2003，22（2）：19-21. ZHANG Xuzhang.The artificial culture and its nutrition composition ofCordyceps militaris（L.Fr.）Link[J].Edible Fungi China,2003,22（2）：19-21.

[9]侯友松，周廣麒，于玲，等.麥芽汁培養基中蛹蟲草液體發酵的研究[J].大連輕工業學院學報，2000，19（4）：271-273.

HOU Yousong,ZHOU Guangqi,YU Ling,et al.Deep fermentation ofCordyceps militarisin wort medium[J].J DalianInst Light Ind,2000,19（4）：271-273.

[10]王國棟.冬蟲夏草類生態培植應用[M].北京：科學技術文獻出版社，1995：168-171.

[11]梁宗琦.我國蟲草屬真菌的研究開發的現狀與思考[J].食用菌學報，2001，8（2）：53-62.

LIANG Zongqi.Current situation and ponderation of Cordyceps Fr.research and exploitation in China[J].ActaEdulis Fungi,2001,8（2）：53-62.

[12]溫魯，夏敏，宋虎衛，等.液體培養蛹蟲草蟲草素和腺苷的代謝量[J].微生物學通報，2005，32（3）：91-94.

WEN Lu,XIA Min，SONG Huwei,et al.The metabolism yield of cordycepin and adenosine inCordyceps militarisby liquid culture[J].Microbiol China,2005,32（3）：91-94.

[13]宋越冬.蛹蟲草魯山株C0511菌絲液體培養條件[J].食用菌學報，2010，17（1）：48-50.

SONG Yuedong.Optimization of selected parameters affecting mycelium production byCordyceps militaris,strain Lu Shan C0511,in submerged culture[J].Acta Edulis Fungi,2010,17（1）：48-50.

[14]尹萍，涂艷麗，王飛，等.北蟲草液體發酵培養基優化研究[J].江西農業學報，2006，18（4）：102-103.

YIN Ping,TU Yanli,WANG Fei,et al.Study on optimization of culture medium ofCordyceps militarisfermentation [J].Acta Agric Jiangxi,2006,18（4）：102-103.

[15]顧寅鈺，張亞平，陳傳杰，等.蛹蟲草培養基碳源和氮源對菌絲生長量的影響[J].山東農業科學，2008（7）：77-79.

GU Yinyu,ZHANG Yaping,CHEN Chuanjie,et al.Effects of carbon and nitrogen sources in culture medium on growth amount ofCordyceps militarishyphae[J].Shandong Agric Sci,2008（7）：77-79.

[16]陳晉安，黃浩，鄭忠輝，等.蛹蟲草液體發酵條件的研究[J].集美大學學報：自然科學版，2001，6（3）：219 -222. CHEN Jinan,HUANG Hao,ZHENG Zhonghui,et al.A study on liquid fermentation ofCordyceps militaris[J].JJimei Univ Nat Sci,2001,6（3）：219-222.

[17]毛永強，李娜.蟲草發酵培養基研究[J].山西農業科學，2009，37（11）：20-22.

MAO Yongqiang,LI Na.Study on the fermentation culture medium of caterpillar fungus[J].J Shanxi Agric Sci,2009,37（11）：20-22.

[18]徐方旭，劉詩揚，王升厚.蛹蟲草液體菌株培養基的優化[J].北方園藝，2011（4）：199-201.

XU Fangxu,LIU Shiyang,WANG Shenghou.Liquid medium for optimization ofCordyceps militaris[J].Northern Horticult,2011（4）：199-201.

[19]宋越冬.蛹蟲草魯山株C0511菌絲液體培養基篩選試驗[J].河南農業科學，2010（12）：107-110.

SONG Yuedong.Selection of submerged culture medium forCordyceps militarisstrain Lushan C0511[J].J Henan Agric Sci,2010（12）：107-110.

[20]王智文.多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）Cp-S316抗真菌活性物質的發酵、分離純化與性質研究[D].泰安：山東農業大學，2007.

WANG Zhiwen.Fermentation，Isolation，Purification and Properties of Antifungal Active Substances Produced by Paenibacillus polymyxzCp-316[D].Taian：Shandong Agricultural University,2007.

[21]ZHANG Nan,QI Zeming，DUAN Huiguo,et al.Optimization of medium composition for production of antifungal active substance fromStreptomyces hygroscopicusBS-112[J].Afri J Microbiol Res,2012,6（1）：71-80.

[22]褚以文.微生物培養基優化方法及其OPTI優化軟件[J].國外醫藥：抗生素分冊，1999，20（2）：58-60，66.

CHU Yiwen.Medium optimization method and OPTI software to optimize the microbial culture[J].World Notes Anti,1999,20（2）：58-60，66.

[23]AMBAT P,AYYANNA C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method[J].World J Microbiol&Biotechnol,2001,17：331-335.

[24]張大皓，譚天偉，王炳武.響應面試驗設計優化脂肪酶發酵培養基[J].北京化工大學學報，2006，33（2）：41-45.

ZHANG Dahao,TAN Tianwei,WANG Bingwu.Response surface analysis of lipase production byPenicillium camembertiiThom[J].J Beijing Univ Chem Technol Nat Sci Ed,2006,33（2）：41-45.

[25]蔡友華，范文霞，劉學銘，等.響應面法優化巴西蟲草發酵培養基的研究[J].食用菌學報，2007，14（2）：55 -59.

CAI Youhua,FAN Wenxia,LIU Xueming,et al.Study on the optimization of medium of BrazilCordycepsfermentation by response surface method[J].Acta Edul Fung,2007,14（2）：55-59.

[26]周廣麒，戴娜.響應面法優化蟲草培養的研究[J].中國釀造，2011（1）：112-115.

ZHOU Guangqi,DAI Na.Optimization of cultivation conditions forCordycepsby response surface methodology[J].China Brewing,2011（1）：112-115.

[27]李珺.響應面法優化蛹蟲草深層發酵工藝[J].黑龍江生態工程職業學院學報，2012，25（6）：32-34.

LI Jun.Optimization ofCordyceps militarisfermentation process by response surface method[J].J Heilongjiang Vocat Inst Ecol Eng,2012,25（6）：32-34.

[28]劉苗苗，寧尚勇，崔西勇，等.響應面法優化蛹蟲草液體培養條件[J].中國農學通報，2008，24（5）：127-131.

LIU Miaomiao,NING Shangyong,CUI Xiyong,et al.Optimization of submerged culture condition forCordyceps militarisusing response surface methodology[J].Chin Agric Sci Bull,2008,24（5）：127-131.

Optimization of a liquid fermentation medium for Cordyceps militaris

YE Jingjing1,CAO Ningning2,LIU Gang1,WU Jianmei1,YIN Hao1,HU Zuozhong1,ZHANG Jianfei1
（1.Sericultural Research Institute,Sichuan Academy of Agriculture,Nanchong 637000,Sichuan,China；2.Nanchong Silkworm Farm of Sichuan Province,Nanchong 637000,Sichuan,China）

To obtain the optimal medium for growth ofCordyceps militarisDY-1,statistical designs were utilized on the fermentation medium.The dry weight of mycelium was measured analytically.First,the carbon source,nitrogen source,and inorganic salts were screened one factor at a time,and the carbon：nitrogen ratio was optimized through orthogonal testing.Then,the Plackett-Burman design was used to screen the critical factors of mycelium production.Last,a central composite design and response surface methodology were utilized to determine the optimal concentrations of the critical factors.After,the optimal medium was used in inoculation experiments to verify the predicted values.Results demonstrated that the optimal media was composed of the following factors：maltose,16.40 g·L-1；yeast extract powder,5.00 g·L-1；KNO3,1.00 g·L-1；MgSO4,0.20 g·L-1；KH2PO4,1.80 g·L-1；and FeSO4,0.02 g·L-1.The practical corresponding response of 32.11 g·L-1was closer to the predicted response of 32.22 g·L-1.Using the optimum medium,the dry weight of the mycelium active substances was effectively enhanced 4.12 times compared with the initial level.The present study laid the foundation for the further research and application ofCordyceps militarisDY-1.[Ch,3 fig.9 tab. 28 ref.]

Cordyceps militaris；dry weight of mycelium；Plackett-Burman design；response surfacemethodology；central composite design

S567.3

A

2095-0756（2014）03-0465-08

2013-07-02；

2013-11-12

四川省農業科學院提升項目新興學科專項（2013XXXK-016）；四川省科技支撐項目（2011NZ0020）；四川省農業科學院提升項目青年基金專項（2013QNJJ-019）；科技部星火計劃項目（2011GA810011）；農業部國家蠶桑產業技術體系養蠶設施與機械崗位項目（CARS-22-ZJ0401）

葉晶晶，助理研究員，從事生物技術及綜合利用研究。E-mail：yjjsuccess2008@163.com。通信作者：張劍飛，副研究員，從事生物技術及綜合利用研究。E-mail：783890694@qq.com