富含纖溶酶低鹽豆醬加工工藝及品質分析

李大鵬，高玉榮，馬 晶

（黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319）

目前心腦血管疾病正日益嚴重的危害著人們的健康，已成為目前全世界人類死亡的主要原因之一[1]。隨著我國人口老齡化形勢日益嚴峻，心腦血管疾病對我國社會的危害還將不斷增加[2-3]。納豆是日本的一種傳統大豆發酵食品，研究發現，納豆中含有的納豆激酶具有很強的溶栓作用，可以防治心腦血管疾病[4]。作為防治心腦血管疾病的主要藥物—尿激酶和蚓激酶，其半衰期較短，而且對人體有很大的副作用，會導致人體的出血[5-6]。微生物產生的溶栓酶不僅直接起到溶栓的作用，而且能激活人體的纖維蛋白溶酶原和尿激酶原，從而表現出很強的間接溶栓作用。因此微生物產生的溶栓酶在人體內的作用時間較長且安全性高[7]。

我國目前對溶栓功能性大豆發酵食品的研究主要是模仿國外的納豆產品，但這些產品由于市場、口味等原因目前很難進行產業化推廣[8-10]。豆醬是我國傳統大豆發酵食品，但我國豆醬在生產中所用的菌種及產品品種單一，生產周期較長，產品中功能性成分的含量較低，食鹽含量高。因此，實驗以篩選出的高產溶栓酶的優良菌株為發酵菌種，研制符合中國人口味的富含溶栓酶的低鹽豆醬。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌M64：實驗室分離獲得的高產纖溶酶菌株，黑龍江八一農墾大學食品學院保藏[11]。

1.1.2 培養基

營養肉湯液體培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH值7.2～7.4。

營養肉湯斜面固體培養基：瓊脂2.0%，其余同營養肉湯液體培養基。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DRP-9082電熱恒溫培養箱：上海森信試驗儀器有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；BCN-1360生物潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低鹽豆醬加工工藝流程

1.3.2 工藝說明

（1）挑選、浸泡、蒸煮：挑選顆粒飽滿，成熟、無霉爛、無蟲蝕的新鮮黃豆。加入黃豆質量2倍的自來水，30℃浸泡4～5h。121℃高壓蒸煮35min，冷卻至40℃以下接種。

（2）菌種活化及擴培：將枯草芽孢桿菌M64斜面菌種1環接入營養肉湯斜面固體培養基中，37℃培養18～24 h。接種培養好的斜面菌種1環到營養肉湯液體培養基中，37℃培養16h。

（3）制曲：將擴培的菌種按照一定接種率接種至蒸煮并冷卻的黃豆中培養。

（4）發酵：將制曲結束后的豆曲，加鹽水，在45～55℃條件下發酵10d 左右。

1.3.3 檢測方法

感官指標分析：按照國家標準GB/T 24399—2009《黃豆醬》[12]中的方法進行。

理化指標分析：氨基酸態氮、水分：按照國家標準GB/T 24399—2009[12]中的方法進行；食鹽含量：按照國家標準GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》[13]中的方法進行；纖溶酶活性測定：采用血纖維蛋白平板法測定[14-15]；蛋白酶活性測定：按照國家標準GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[16]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 豆醬制曲工藝研究

豆豉制曲的目的是使菌種在蒸煮后的豆粒上生長并產酶，為了生產具有溶栓功能的豆醬，需要使菌在產生蛋白酶的同時產生大量的纖溶酶。因此蛋白酶和纖溶酶活力的高低是檢驗制曲品質的指標。實驗以蛋白酶和纖溶酶的活力為指標，研究了接種量、制曲溫度和制曲時間對酶活力的影響，以確定最佳的制曲工藝條件。

2.1.1 接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

將蒸煮冷卻后的大豆，按照不同的接種量接種后，在36℃、相對濕度85%的條件下培養24 h后，纖溶酶和蛋白酶活力如圖1所示。由圖1可以看出，由于接種量影響菌體的生長量，纖溶酶和蛋白酶都是枯草芽孢桿菌M64的次級代謝產物，導致接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響呈現相同的趨勢。當接種量為0.5%～1.5%時，隨著接種量的增加，纖溶酶和蛋白酶活力顯著增大，接種量繼續增加，酶產量不再增加。這主要是由于接種量過大時，菌體過量生長，導致營養物質的過量消耗、代謝產物產量下降，因此適宜的接種量為1.5%。

圖1 接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum on fibrinolytic enzyme andprotease activity

2.1.2 制曲溫度對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

圖2 溫度對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on fibrinolytic enzyme and protease activity

將蒸煮冷卻后的大豆，接入1%的枯草芽孢桿菌M64菌懸液，相對濕度85%，在不同的溫度條件下培養24h后，纖溶酶和蛋白酶活力如圖2所示。由圖2可以看出，溫度對纖溶酶和蛋白酶活力影響顯著。36℃時纖溶酶活力最大，而32℃時蛋白酶活力最大，但32℃和36℃時蛋白酶活力差異不顯著，因此，適宜的發酵溫度選擇為36℃。

2.1.3 制曲時間對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

圖3 時間對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of time on fibrinolytic enzyme and protease activity

將蒸煮冷卻后的大豆接入1%的菌懸液，32℃、相對濕度85%培養不同時間后，纖溶酶和蛋白酶活力見圖3。由圖3可以看出，發酵時間對纖溶酶和蛋白酶活力影響顯著。當發酵時間＜36h時，隨著發酵時間的延長活力逐漸增大，當發酵時間＞36h時，纖溶酶和蛋白酶的活力不再增大。因此，適宜的發酵時間為36h。

在單因素確定的最佳制曲條件：接種量1.5%，制曲溫度36℃，制曲時間36h進行3次平行實驗，實驗結果見表1。

表1 最佳制曲條件下的酶活性Table 1 Enzyme activity under the optimal koji-making condition

由表1可見，在最佳的制曲條件下，豆曲中的蛋白酶和纖溶酶活性分別可達3 432U/g和2 168U/g。

2.2 發酵工藝研究

發酵豆醬時，在制曲過程中產生的蛋白酶使物料中的蛋白質等大分子物質分解成氨基酸等小分子物質。氨基酸態氮含量是豆醬主要的理化指標，因此實驗研究加水量、發酵溫度和時間對氨基酸態氮含量的影響，以確定豆醬發酵工藝條件。

2.2.1 加水量對豆醬氨基酸態氮含量的影響

圖4 加水量對豆醬氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Effect of water addition on amino acid nitrogen content of soybean paste

將大豆曲加入不同量的8%鹽水，45℃密閉發酵6d，氨基酸態氮的含量見圖4。由圖4可以看出，隨著加水量的增加，豆醬中氨基酸態氮含量呈上升趨勢，但當加水量高于90%時，蛋白水解基本完全，隨著加水量的增加氨基酸態氮含量開始降低，因此最適加水量為90%。

2.2.2 食鹽質量分數對豆醬氨基酸態氮含量的影響

將大豆曲添加不同質量分數的鹽水，45℃密閉發酵6d，氨基酸態氮的含量見圖5。由圖5可以看出，隨著食鹽含量的增加，豆醬中的氨基酸態氮含量呈下降的趨勢，當食鹽含量＞10%時，氨基酸態氮含量顯著降低，因此選擇適宜的食鹽質量分數為10%。

圖5 食鹽質量分數對豆醬氨基酸態氮含量的影響Fig.5 Effect of salt concentration on amino acid nitrogen content of soybean paste

2.2.3 發酵溫度對豆醬氨基酸態氮含量的影響

圖6 發酵溫度對豆醬氨基酸態氮含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content of soybean paste

將大豆曲添加10%質量分數的鹽水，不同溫度下密閉發酵6d，氨基酸態氮的含量見圖6。由圖6可以看出，隨著溫度的升高，氨基酸態氮含量逐漸增加，但當溫度高于50℃時，氨基酸態氮含量開始下降，這說明豆醬發酵過程中，蛋白酶最適作用溫度為50℃。溫度過高，使過多氨基酸與糖反應生成類黑素類物質，豆醬顏色過深，營養物質損失較大，因此，選擇最適發酵溫度為50℃。

2.2.4 發酵時間對豆醬氨基酸態氮含量的影響

將大豆曲添加質量分數為10%鹽水，45℃密閉發酵一定時間后，氨基酸態氮的含量見圖7。由圖7可以看出，隨著發酵時間的延長，豆醬中的氨基酸態氮含量呈現先上升后下降的趨勢。這是由于隨著發酵時間的延長，豆曲中的蛋白質逐漸被蛋白酶水解釋放出來，但當發酵時間超過7d后，此時蛋白已被完全水解，隨著時間的延長，還有一部分氨基酸會在較高的溫度條件下發生美拉德反應，降低氨基酸的含量，因此，選擇最適的發酵時間為7d。

圖7 發酵時間對豆醬氨基酸態氮含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on amino-acid nitrogen content of soybean paste

2.3 產品品質分析

2.3.1 感官指標分析

表2 豆醬感官分析結果Table 2 Organoleptic analysis of soybean paste

由表2可以看出，實驗研制的溶栓功能低鹽豆醬顏色、香氣、滋味和體態符合GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求。

2.3.2 理化指標分析結果

表3 豆醬理化指標分析結果Table 3 Physicochemical indexes of soybean paste

由表3可以看出，實驗研制的豆醬的水分含量符合國家標準（≤65.0g/100g），氨基酸態氮含量達到0.74g/100g，高于國家標準0.6g/100g的要求，這說明研制的豆醬在發酵過程中蛋白等大分子物質水解完全，產品中的氨基酸等營養物質容易被人體吸收利用。一般豆醬中食鹽含量＞9%，而實驗研制的豆醬含鹽量為傳統豆醬的50%，含鹽量低。豆醬中的纖溶酶活性達到1 070U/g。

3 結論

以蛋白酶和纖溶酶的活力為指標，確定了富含纖溶酶活性豆豉的制曲工藝條件為接種量1.5%，制曲溫度36℃，制曲時間36h，在此條件下豆曲中的蛋白酶和纖溶酶活性為3 432U/g和2 168U/g。

以氨基酸態氮含量為指標，研究確定了豆醬最佳發酵工藝條件為加水量90%，食鹽質量分數10%，發酵溫度50℃，發酵時間7d，在此條件下豆醬中的氨基酸態氮含量為0.76%。

研制的富含溶栓酶低鹽豆醬的感官指標和理化指標符合豆醬的國家標準GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求，食鹽含量4.72g/100g，為傳統豆醬的50%，纖溶酶活性的達到1 070U/g。

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