核桃多肽體外抗氧化活性研究

賈靖霖，陸健康，汪莉莉，王小茹，侯旭杰*

（塔里木大學 生命科學學院 南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

核桃（Julans ragia.）是一種兼具營養(yǎng)價值和經濟價值的珍貴果木，同時也是世界上一種非常重要的堅果類果樹和木本油料樹種[1]。當前，核桃種植面積全球共有228.36萬hm2，總產量為256.87萬t。據《中國果樹志》核桃卷記載[2]，中國種植的核桃面積為66.7萬hm2，品種（系）有216個，有2億多株是實生果樹，實生農家品種164個，優(yōu)良單株系486個，年產量164.91萬t，位居世界首位。

新疆盛產核桃，2011年核桃種植總面積（不含兵團）達28.02萬hm2，產量達23.42萬t，占全國總產量的17.8%，主要分布在阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)，是名符其實的核桃主產區(qū)[3]。隨著“國家木本油料產業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略”的實施、核桃良種化進程的加快、標準化生產技術的推廣應用、技術管理和物化投入水平的提高，預計到2015年全疆核桃產量將達到40萬t以上[4]。南疆核桃資源豐富、品質優(yōu)良，主要品種有新豐、扎-343、溫-179、新2號、溫-185等。其中溫-185核桃于1989年通過林業(yè)部門鑒定[5]，具有豐產、早熟、抗逆性強、殼薄等特性。隨著南疆核桃產業(yè)的迅速發(fā)展，溫-185核桃在南疆核桃產業(yè)中的地位將會越來越重要。

目前對溫-185核桃的研究主要集中在溫185-核桃的豐產栽培技術[6]、核桃殼斷口形貌的研究[7]、不同方法制備核桃油的研究[8]等，有關溫-185核桃多肽的研究較少。本研究將以前期試驗制備的核桃多肽為原料，探討不同水解度的核桃多肽液的體外抗氧化活性，以期為今后溫-185核桃綜合利用及開發(fā)成各種營養(yǎng)保健食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃薄皮溫-185：新疆阿拉爾市禾普商貿城；維生素C、維生素E、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、焦性沒食子酸、體積分數95%乙醇、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、30%雙氧水：上海山浦化工有限公司；磷酸二氫鈉：天津福晨化學試劑廠；磷酸氫二鈉：天津博迪化工股份有限公司；濃鹽酸：天津市風船化學試劑科技有限公司；Tris、二苯代苦味酰自由基：美國Sigma公司；堿性蛋白酶（1×105U/g）、中性蛋白酶（1.3×105U/g）、酸性蛋白酶（5×104U/mg）：上海藍季科技發(fā)展有限公司；化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR2140電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；88-1磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；211C酸度計：北京哈納科儀科技有限公司；FD-10-80冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JH756紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃多肽的制備[9]

核桃蛋白的制備采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法[2，10]，制備工藝流程如下：

核桃→核桃仁→榨油→核桃粕→體積分數95%乙醇洗滌→過濾→濾餅揮干溶劑→定容→調pH值為9.0→磁力攪拌1h（40℃）→離心（5 000r/min、15min、25℃）→取上清液→調pH值為4.5→磁力攪拌1 h（40℃）→離心（5 000r/min、15min、25℃）→取沉淀→40℃水洗至中性→冷凍干燥→核桃蛋白粉

多酶協(xié)同水解核桃蛋白采用分步依次加酶，不同酶解時間制備出2種不同水解度（degree of hydrolysis，DH）的多肽液，其酶解工藝流程如下：

最優(yōu)條件制得核桃多肽液：稱取核桃蛋白粉→定容→調pH值為9.5→加堿性蛋白酶→水浴酶解（5h、50℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調pH值為8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（6h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調pH值為3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（4h，40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→冷卻→冷凍離心→取上清液→測定水解度[4]。

最優(yōu)條件下酶解時間減半制得多肽液：稱取核桃蛋白粉→定容→調pH值為9.5→加堿性蛋白酶→水浴酶解（2.5h、50℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調pH值為8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（3h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調pH值為3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（2h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→冷卻→冷凍離心→取上清液→測定水解度[4]。

1.3.2 水解度測定[10]

核桃多肽液中氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法測定，總氮按照國標GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行測定，水解度（DH）按下式計算：

1.3.3 核桃多肽總還原能力的測定[11]

核桃多肽總還原能力的測定采用普魯士蘭法。在2.5mL磷酸緩沖溶液（pH 6.6）中分別加入樣品、維生素C、維生素E，添加量均為0、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL，雙蒸水1.0mL、0.95mL、0.90mL、0.85mL、0.80mL、0.75mL、0.70mL，再加入質量分數1%鐵氰化鉀1mL，混合物在50℃恒溫條件下，加熱20min后，急速冷卻，加2.5mL 10%三氯乙酸，3 500r/min離心分離10min。取上層清液2.5mL、雙蒸水2.5mL，再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10min后在波長700nm條件下測吸光度值A700nm。A700nm越大，則樣品的總還原力越大，抗氧化性就越好。

1.3.4 核桃多肽清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力測定[12]

采用鄰苯三酚自氧化法。取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液6mL，加入0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的樣品各0.5mL，37℃水浴10min，最后加入37℃預熱過的7mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液1mL，混勻后反應4min，用0.5mL濃鹽酸終止反應，在波長325nm處測定其吸光度值A325nm，以等體積pH值為8.2的Tris-HCl 緩沖液作為空白吸光度值A0，超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白吸光度值；A為樣品的吸光度值。

1.3.5 核桃多肽清除羥自由基（·OH）能力測定[13]

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法。吸取15mmol/L的鄰二氮菲應用液1.5mL，先加入pH值為7.4的磷酸鈉緩沖液4mL，充分混勻后再加入7.5mmol/L的FeSO4溶液1mL，立刻混勻。加入1mL質量濃度分別為0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的樣品溶液后立即混勻，再加入1.5mL雙蒸水，最后加入1%的H2O2溶液1.0mL，以雙蒸水代替H2O2溶液，在波長536nm處測定其吸光度值A536nm，羥自由基清除率計算公式如下：

式中：A加藥為加入樣品（抗氧化劑）及H2O2溶液的吸光度值；A損傷為加H2O2而不加抗氧化劑溶液的吸光度值；A未損為兩者都不加的溶液的吸光度值。

1.3.6 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）能力測定[14-15]

在10mL比色管中依次加入pH值為6.86磷酸鹽緩沖液4mL，2×10-4mol/L的DPPH溶液（用體積分數95%乙醇配制）4mL，搖勻。再加入1mL待測液，用蒸餾水定容至10.00mL刻度，充分混勻，10min后用體積分數95%乙醇作參比，在波長520nm處測定其吸光度值，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度值；Aj為不加DPPH，只加抗氧化劑及水的溶液的吸光度值；Ac為不加抗氧化劑，只加DPPH及水的溶液的吸光度值。

1.3.7 統(tǒng)計分析

數據均采用（平均值±標準差）表示；統(tǒng)計分析軟件DPS 7.55對結果進行單因素方差分析和檢驗。

2 結果與分析

2.1 水解度的測定

最優(yōu)條件制得的核桃多肽液水解度為45.58%，最優(yōu)條件下酶解時間減半制得的核桃多肽液水解度為30.92%。

2.2 核桃多肽總還原能力的測定

核桃多肽的總還原能力與VC的總還原能力進行比較，結果見圖1。

圖1 核桃多肽總還原力測定Fig.1 Determination of total reducing power of different samples

由圖1可知，核桃多肽液水解度為45.58%的總還原能力稍優(yōu)于水解度為30.92%，但2種水解度的酶解液還原效果均弱于VC，且隨著多肽液質量濃度的升高，樣品的總還原能力也逐漸升高，后又基本趨于穩(wěn)定，達到了VC總抗還原能力的60%～80%。說明其具有一定的總還原能力，即核桃多肽有一定的抗氧化性。

2.3 核桃多肽清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力測定

圖2 不同水解度下核桃多肽質量濃度對O2-·的清除率Fig.2 Effect of walnut polypeptide concentration on O2-·scavenging activity under different hydrolysis degree

不同水解度下核桃多肽對O2-·的清除率結果見圖2。由圖2可知，核桃多肽液的質量濃度與超氧陰離子自由基的清除率呈現一定的量效關系，隨質量濃度增加，超氧陰離子自由基的清除率呈現逐漸上升的趨勢，核桃多肽液水解度為30.92%對超氧陰離子自由基的清除率稍優(yōu)于水解度為45.58%，但2種水解度的酶解液對超氧陰離子自由基的清除效果均弱于VC，表明核桃多肽具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力。

2.4 核桃多肽清除羥基自由基（·OH）能力測定

不同水解度下核桃多肽液對·OH的清除率結果見圖3。由圖3可知，核桃多肽液對羥基自由基有較明顯的清除作用，且隨著核桃多肽液質量濃度的升高，其清除率也逐漸增強，核桃多肽液水解度為45.58%對羥基自由基的清除率優(yōu)于水解度為30.92%，但2種水解度的核桃多肽液對羥基自由基的清除能力都低于VC，說明其具有一定的抗氧化能力。

圖3 不同水解度下核桃多肽質量濃度對·OH的清除率Fig.3 Effect of walnut polypeptide concentration on·OH scavenging activity under different hydrolysis degree

2.5 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH）能力測定

不同水解度下核桃多肽液對DPPH的清除率見圖4。由圖4可知，水解度為45.58%及30.92%核桃多肽液對DPPH自由基都有清除作用，并且二者清除效果差別不大。在較低質量濃度時遠低于VC的清除率，但隨著其質量濃度的升高，DPPH自由基清除率逐漸上升，直到當核桃多肽質量濃度達到0.6mg/mL時清除率逐漸趨于穩(wěn)定，說明核桃多肽具有一定的抗氧化性。

圖4 不同水解度下核桃多肽液質量濃度對DPPH的清除率Fig.4 Effect of walnut polypeptide concentration on DPPH scavenging activity under different hydrolysis degree

3 結論

采用新疆產溫-185核桃，利用榨完油后的殘渣提取不同水解度核桃蛋白，并制備不同水解度的多肽液。以VC為對照，探討了核桃多肽的總還原能力、對不同自由基的清除能力以及不同質量濃度對自由基清除率的影響。結果表明，核桃多肽對超氧陰離子自由基、羥基自由基以及DPPH自由基有一定的清除作用，且呈現出一定的量效關系，說明核桃多肽具有一定的抗氧化能力，有作為天然抗氧化劑進一步開發(fā)利用的價值。

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