不同促溶劑對酵母細胞在發(fā)酵液中自溶的影響

冀紅芹，甄玉國，2 *，劉乙辰，趙小麗，陳 雪

（1.吉林農業(yè)大學吉農博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林 長春 130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術中心，吉林 長春 130114）

隨著我國及世界飼料工業(yè)的發(fā)展和蛋白質資源的日益匱乏[1]，酵母越來越多的受到人們的關注。酵母的應用極為廣泛，主要是因為其營養(yǎng)物質豐富：優(yōu)質蛋白質含量達40%～60%，氨基酸成分含量較高且比例均衡，還含有酵母菌分泌的蛋白酶、消化酶、核苷酸、B族維生素、小肽等具有生物活性的成分[2]。酵母細胞壁的主要活性成分β-葡聚糖和甘露寡糖具有通過刺激機體細胞和體液免疫來提高免疫性能、促進有益菌生長以及抑制有害菌生長的作用，維持腸道和動物機體健康[3]。

然而，其獨特而堅固的細胞壁結構使酵母的利用率較低。本試驗通過不同方式的自溶，將酵母細胞內的營養(yǎng)物質釋放出來。產物富含核苷酸、B族維生素、活性小肽、游離氨基酸及酵母細胞壁多糖等多種成分，兼有酵母原生質成分和酵母細胞壁多糖兩部分的營養(yǎng)性能和生物活性功能。

酵母細胞自溶通過改變環(huán)境條件，激活酵母細胞本身含有的蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶和葡聚糖酶等多種內源酶，將細胞內的大分子化合物水解成小分子，然后通過細胞壁的孔隙滲透到細胞外。由于酵母細胞內源酶活力有限，并且在自溶過程中不斷降低，自溶率很難提高[4]。

提高酵母細胞自溶率的方法主要有3種，（1）運用物理方法如高壓均質、超聲波、溫差法等將酵母細胞破壁，使內容物溢出；（2）化學方法：通過添加NaCl、乙醇、硫胺素等化學物質，調節(jié)酵母細胞內外的滲透壓、改變細胞膜通透性、刺激酵母細胞內源酶的活性，提高酵母自溶的得率；（3）生物學手段：采用外加酶促進酵母細胞壁或胞內大分子的水解來提高酵母自溶得率[5]。

通過研究添加不同促溶劑（NaCl、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶等），探討其對酵母細胞在發(fā)酵液中自溶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母發(fā)酵液（自制）；NaCl、木瓜蛋白酶（活力＞800U/mg）、β-葡聚糖酶（活力＞5 000 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pHS-2C型數字式酸度計：上海SANXIN公司；MS分析天平：美國梅特勒-托利多公司；島津UV-1201分光光度計：日本島津公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；HH-S2數顯恒溫水浴鍋：金南儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗工藝

取高密度流加發(fā)酵所得酵母發(fā)酵液（菌體密度為干質量30g/L），控制條件（NaCl添加量/酶添加量、溫度、時間、pH）自溶后，置于85℃水浴保持15min滅酶活，5 000r/min離心10min，測定酵母細胞自溶后胞內物質的得率。

1.3.2 指標測定方法

將自溶后的發(fā)酵液5 000r/min 離心后，分離上清液和沉淀，將上清液烘干至質量恒定，胞內物溶出率計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 以NaCl為促溶劑的自溶

據報道[6]，氯化物、乙醇、乙酸乙酯、硫胺素、脂肪酸鈉、甲苯、硫醇類試劑、氮酮、酵母抽提物、右旋糖等都能起到促進酵母自溶的作用。其中NaCl作為安全經濟的促溶劑，經常被用在酵母自溶中。NaCl可以通過提高酵母細胞外環(huán)境中的滲透壓，促進酵母細胞內的原生質體為達到與環(huán)境中滲透壓平衡而失水，形成了質壁分離，導致細胞內容物外溢。質壁分離達到一定時間后會引起細胞死亡，酵母細胞由此開始降解。NaCl可以加速酵母自溶，縮短生產時間，同時對核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的降解也有促進作用，可以增大底物對核糖體核糖核酸（ribo somal RNA）裂解酶的敏感程度，且核糖體吸附核糖核酸酶的能力會因NaCl濃度的提高而下降，從而使核糖核酸酶活性增強[7]。

2.1.1 NaCl添加量對酵母自溶的影響

添加NaCl能使酵母細胞內外產生滲透壓差，有利于胞內物質的外溢，并且具有一定程度的防腐作用。

取發(fā)酵液30mL，將pH調節(jié)為5.0，添加不同含量的NaCl，在55℃自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率。酶添加量分別為酵母細胞干質量的0%、3%、6%、9%、12%。

由圖1可知，NaCl添加量為0%～12%時，酵母細胞胞內物的溶出率有先升高后降低的趨勢，在NaCl添加量為9%時達到最大值。隨后稍有降低，可能由于NaCl添加量較高時，影響酵母細胞內源酶的活性。因此，酵母細胞在發(fā)酵液中的自溶，NaCl為最適宜添加量為9%。

圖1 NaCl添加量對酵母自溶的影響Fig.1 Effect of NaCl addition on yeast autolysis

2.1.2 pH對酵母自溶的影響

酵母自溶是一個在多種內源酶共同參與并協(xié)同作用的酶促反應過程，各種酶（蛋白酶、核酸酶、β-葡聚糖酶等）的最適pH值各不相同。蛋白酶作為酵母自溶中最重要的內源酶，其適宜的pH值分別為7.5、6.5、6.2 和3.5[8]；核酸酶的最適pH值為5～7[9]，β-葡聚糖酶的最適pH值為4.5～4.8。據報道，酵母自溶時的最適pH值為5～8，當pH＞8時自溶液易產生不良氣味甚至變質。

取發(fā)酵液30mL，添加9%NaCl，調節(jié)pH分別為3、4、5、6、7，在55℃自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率，結果如圖2所示。

圖2 pH對以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.2 Effect of pH on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

由圖2可知，pH對酵母細胞的自溶具有顯著影響。當pH值為3～5時，隨著pH值的逐漸增大，酵母細胞胞內物溶出率明顯上升，當pH值為5時達到最大。這是因為當pH值為5時，達到了酵母體內自溶酶系的最適pH值，自溶酶可以充分水解底物；隨著pH的降低，內源酶系對底物的水解的作用受到抑制，影響自溶效果，過低的pH會使酶的三維結構改變進而致其失活，pH值為3時，胞內物的溶出率低于其他各組；當pH值＞5時，隨著pH值的增加自溶效果下降。因此，酵母在發(fā)酵液中自溶的pH選擇5為最適宜。

2.1.3 溫度對酵母自溶的影響

自溶內源酶的活性受到環(huán)境溫度的影響，而酵母細胞內源酶系中的每種酶都需要不同的最適溫度。如酵母核酸酶的最適宜溫度為55℃，蛋白酶的最適溫度范圍在30～60℃[10]。

取發(fā)酵液30mL，添加9%NaCl，調節(jié)pH值為5，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃自溶24 h，測定酵母細胞胞內物的溶出率，結果如圖3所示。

圖3 溫度對以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.3 Effect of temperature on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

由圖3可知，當溫度為55℃時，酵母細胞內容物溶出率最高，酵母細胞內源酶系統(tǒng)可以發(fā)揮最大的活性。因此，酵母在發(fā)酵液中的自溶的溫度選擇55℃為最適宜。

2.1.4 時間對酵母自溶的影響

在50℃、pH 5.0、NaCl添加量為9%條件下自溶，測其酵母細胞胞內物的溶出率，結果如圖4所示。酵母細胞死亡需要一定的時間，只有細胞死亡后，胞內的各類水解酶系才能被活化發(fā)揮作用。由圖4可知，在本試驗所選的時間內自溶過程中酵母細胞內容物是不斷溢出的，16h內增加迅速，而16h后一直緩慢增加，與寧正祥[11]的研究酵母細胞的自溶可以在5d內持續(xù)進行一致。由于酵母細胞自溶自溶時間過長會導致染菌而時間過短不能有效的獲取酵母細胞內容物，因此選擇48h為宜。

圖4 時間對以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.4 Effect of time on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

2.1.5 以NaCl為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗

為得到影響酵母細胞內容物得率的主次因素，獲得以NaCl為促溶劑的酵母自溶最佳工藝條件，在單因素試驗基礎上，進一步采用L9（34）正交試驗設計，試驗設計及結果見表1。

表1 以NaCl為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using NaCl as cosolvent

由表1可知，4個因素對自溶影響的大小順序為pH值＞溫度＞時間＞NaCl添加量。由正交試驗得出以NaCl為促溶劑的酵母發(fā)酵液內的自溶條件為A2B2C1D2，即pH5，溫度50℃、時間48h、NaCl添加量為9%。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗測得酵母細胞在發(fā)酵液內自溶，酵母細胞胞內物溶出率達到49.30%。

2.2 以葡聚糖酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗

由酵母細胞自溶原理可以得知，影響酵母自溶的主要因素是其細胞壁的結構[12]。細胞壁一般占酵母干質量的25%左右，并且由三層組成類似三明治的結構，由內層向外分別為β-葡聚糖、蛋白質和甘露寡糖。β-葡聚糖是維持酵母細胞壁剛性的主要功能性成分，其中大部分為β-1，3-葡聚糖。β-葡聚糖酶的主要作用是水解細胞壁的β-葡聚糖，使其多聚糖鏈斷裂，擴大細胞壁上的孔隙[13]。由此促進細胞內容物外溢，從而提高了酵母自溶時酵母細胞內容物的得率。

2.2.1 酶的添加量對酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調節(jié)為5.0，添加不同含量的β-葡聚糖酶，在55℃下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率。酶添加量分別為酵母細胞干質量的0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶添加量的增加，酵母細胞胞內物溶出率逐漸增高，添加量在0～0.6%范圍內，酵母細胞胞內物溶出率顯著增加，而0.6%～1.2%范圍內胞內物溶出率無顯著差異。因此，從經濟上考慮，β-葡聚糖酶的添加量為0.6%。

圖5 葡聚糖酶添加量對酵母自溶的影響Fig.5 Effect of β-glucanas addition on yeast autolysis

2.2.2 溫度對酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調節(jié)為5.0，添加0.6%的β-葡聚糖酶，在不同溫度條件下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率。溫度分別為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，結果如圖6所示。

圖6 溫度對以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.6 Effect of temperature on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

由圖6可知，溫度為50～55℃時，酵母細胞胞內物溶出率顯著高于其他溫度，其中50℃時最高。因此，以β-葡聚糖酶在此自溶體系中的最適溫度為50℃，此結果與以NaCl為促溶劑的結果一致，說明在此溫度下，外加β-葡聚糖酶與酵母細胞內源酶系在此發(fā)酵液中可以共同保持反應活性。

2.2.3 pH對酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，添加0.6%的β-葡聚糖酶，分別調節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在，50℃溫度條件下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率，結果見圖7所示。

由圖7可知，β-葡聚糖酶的最適pH為6.0～6.5[14]，從以NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶結果可以得到酵母細胞內源酶進行自溶的最適宜pH值為5，結果在pH值為5和6分別有一個峰值，由在NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶結果可知，pH為5.0 的時候酵母細胞內源酶起主要作用；所以pH為6.0時，外加酶起主要作用。因此，以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母細胞自溶最適宜pH為6。

圖7 pH對以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.7 Effect of pH on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

2.2.4 時間對酵母自溶的影響

在50℃、pH 6.0、β-葡聚糖酶添加量為1%條件下自溶，測其酵母細胞內容物隨時間推移的溢出量變化曲線見圖8。

圖8 時間對以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.8 Effect of time on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

由圖8可知，隨著時間的延長，酵母細胞內容物的溶出率不斷增加，作用16h時還在顯著增加。作用時間超過24h后則緩慢增加。

為使酵母細胞內容物有效的溶出，且不會由于作用時間過長而導致染菌，選取48h為最佳自溶時間。

2.2.5 以β-葡聚糖為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶方案進行綜合優(yōu)化。選取β-葡聚糖酶添加量、pH值、溫度、時間進行4因素3水平正交試驗。試驗設計和結果分析見表2。

由表2可知，4因素對自溶影響的大小順序為添加量＞時間＞溫度＞pH值。由正交試驗得出以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母發(fā)酵液內的自溶條件為：pH 6.5，溫度55℃、時間24h、酶添加量為0.6%。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗測得酵母細胞在發(fā)酵液內自溶，酵母細胞胞內物溶出率達到49.98%。

表2 以β-葡聚糖酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗結果與分析為促溶劑的自溶正交表Table 2 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using β-glucanas as cosolvent

2.3 以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶

外加蛋白酶可以降解酵母細胞壁和細胞膜表面的蛋白、增大細胞壁孔隙，并且將細胞內的大分子蛋白水解為可以通過細胞壁孔隙的小肽和氨基酸，溶進自溶液中。據報道，最有效的促進酵母水解的酶類是巰基蛋白酶，主要有木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等，木瓜蛋白酶效果最顯著[15]。

木瓜蛋白酶（papain）簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（carica papaya）果實中的乳汁，采用現代生物工程技術提煉而成的純天然生物酶制品，其是一種含疏基（-SH）肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力。

魏丕芳等[16]研究結果顯示，啤酒廢酵母正常自溶對細胞壁甘露聚糖有一定的水解作用，加鹽可減緩甘露糖的游離，外加木瓜蛋白酶可強烈的破壞甘露聚糖。

2.3.1 木瓜蛋白酶的添加量對胞內物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調節(jié)為5.0，添加不同含量的木瓜蛋白酶，在55℃下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率，結果見圖9。酶添加量分別為酵母細胞干質量的0%、0.5%、1%、2%。

由圖9可知，添加木瓜蛋白酶的試驗組結果均高于不添加酶的對照組。酶的添加量為0.5%時，酵母細胞胞內物溶出率達到最大值，增加酶的添加量并不能進一步提高溶出率。因此，酵母細胞在發(fā)酵液中自溶時所需木瓜蛋白酶的最適添加劑量為酵母細胞干質量的0.5%。

2.3.2 溫度對胞內物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調節(jié)為5.0，添加0.5%的木瓜蛋白酶，在不同溫度條件下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率。溫度分別為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，結果如圖10所示。

圖9 木瓜蛋白酶添加量對酵母自溶的影響Fig.9 Effect of papain addition on yeast autolysis

圖10 溫度對以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.10 Effect of temperature on yeast autolysis based on papain as cosolvent

由圖10可知，在45～65℃范圍內，隨著溫度的升高，酵母細胞胞內物溶出率出現兩個峰值，分別在50℃、60℃，這是因為以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶是一個酵母內生酶和外加酶聯合作用的反應過程，木瓜蛋白酶的適宜作用溫度為60～65℃，而酵母細胞內源酶系的最佳反應溫度為50℃。

2.3.3 pH值對胞內物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，添加0.5%的木瓜蛋白酶，分別調節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在50℃溫度條件下自溶24h，測定酵母細胞胞內物的溶出率，結果如圖11所示。

圖11 pH對以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.11 Effect of pH on yeast autolysis based on papain as cosolvent

由圖11可知，木瓜蛋白酶的最適pH為6.0～6.5，結果在pH為6.0時達到最大值。因此，以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶最適宜pH為6.0。

2.3.4 時間對酵母自溶的影響

在50℃、pH 6.0、木瓜蛋白酶添加量為1%條件下自溶，測其酵母細胞內容物隨時間推移的溢出量變化曲線，以確定其自溶時間，結果見圖12。由圖12可知，72h內隨著自溶時間的延長，酵母細胞胞內物溶出率不斷增加。為使酵母細胞內容物有效的溶出，且不會由于作用時間過長而導致染菌，選取48h為最佳自溶時間。

圖12 時間對以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.12 Effect of time on yeast autolysis based on papain as cosolvent

2.3.5 以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶方案進行優(yōu)化。選取木瓜蛋白酶添加量、pH值、溫度、時間進行4因素3水平正交試驗，試驗設計和結果分析見表3。

表3 以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using papain as cosolvent

由表3可知，4因素對自溶影響的大小順序為溫度＞pH值＞添加量＞時間。由正交試驗得出以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母發(fā)酵液內的自溶條件為pH 6，溫度60℃、時間72 h、酶添加量為1%。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗測得酵母細胞在發(fā)酵液內自溶，胞內物溶出率達到51.53%。

比較3種不同促溶劑下酵母細胞在發(fā)酵液中自溶所得酵母細胞胞內物的溶出率，結果表明木瓜蛋白酶作為促溶劑時酵母細胞內容物的得率最高，比NaCl為促溶劑時提高2%左右，即外加酶促進酵母細胞自溶的效果較小。由于應用高密度發(fā)酵所得酵母菌直接自溶，與啤酒廢酵母泥相比本試驗中的酵母菌具有較高活性，細胞壁厚且堅固，自溶率難以提高，試驗結果與陶興無[5]所得面包酵母酶促自溶結果一致。

3 結論

綜合以上結果可以如下結論：木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶均可以促進酵母細胞自溶，酵母細胞內容物溶出率提高2%左右。

[1]饒應昌，譚鶴群.我國飼料資源的缺口原因及其對策的探討[J].飼料工業(yè)，2000（3）：5-6.

[2]謝幼梅.飼用酵母的質量鑒別[J].農業(yè)知識，2000（16）：42.

[3]趙芳芳，張日俊.酵母細胞壁生理功能及其應用[J].中國飼料，2003，（17）：17-19.

[4]李 祥，彭 莉，王 毅，等.酵母自溶研究[J].中國釀造，2001，20（5）：17-19.

[5]陶興無.外加酶提高酵母自溶抽提物得率的研究[J].中國釀造，2004，23（12）：13-16.

[6]江 凌，田小群，朱明軍，等.自溶-酶聯技術制備啤酒廢酵母抽提物工藝及產物理化參數研究[J].現代食品科技，2008，124（5）：444-447.

[7]李 楊，包清彬，孔 凌，等.酵母抽提物自溶工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2011（5）：62-65.

[8]王治權，陳遠何，尚水英.啤酒酵母實用技術[M].上海：上海科學普及出版社，1990.

[9]陳 潔，王 璋.酵母抽提物中呈味核苷酸含量偏低的原因探討（1）啤酒酵母中核酸酶性質研究[J].食品科學，2005，25（1）：108-111.

[10]楊建梅，李 紅，杜金華.啤酒廢酵母自溶條件的研究[J].中國釀造，2012，31（2）：95-99.

[11]寧正祥.酵母細胞自溶動力學研究[J].微生物學報，1994，34（3）：213-219.

[12]鄒東恢，江 潔.β-葡聚糖酶的開發(fā)與應用研究[J].農產品加工，2005（8）：7-9.

[13]MADDOX IS，HOUGH JS.Proteolytic enzymes ofSaccharomyces carlsbergensis[J].Biochem J，1970，117（5）：843-852.

[14]宮春波，謝麗源.β-葡聚糖酶及在啤酒工業(yè)中的應用[J].廣州食品工業(yè)科技，2002，18（1）：58-59.

[15]MILIC T V,RAKIN M,MARINKOVIC S S.Utilization of baker's yeast(Saccharomyces cerevisiae) for the production of yeast extract:effects of different enzymatic treatments on solid,protein and carbohydrate recovery[J].J Serb Chem Soc,2007,72(5):451-457.

[16]魏丕芳.不同自溶方式對啤酒廢酵母甘露聚糖的降解作用[J].食品研究與開發(fā)，2008（9）：75-77.