優良酵母菌連續混合發酵赤霞珠葡萄酒的研究

徐亞男，張彥位，劉 研，盛 赟，王 月，趙九洲，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒是經酵母發酵葡萄汁而成的具有濃郁果香、酸味適中的低醇飲料[1]。葡萄酒風味物質主要來源于葡萄本身和由酵母發酵代謝產生的物質，其含量和組成比例決定著葡萄酒的特性。酵母菌株是葡萄酒品質的靈魂，對葡萄酒色澤、香氣、感官質量和風味的影響非常重要，用不同菌株發酵生產的葡萄酒，其酒質和風味大不一樣。新疆獨特的氣候特點注定了其在葡萄酒行業的優勢，新疆地區高熱、少雨、日照時間長，使釀酒葡萄著色深、糖度高，適宜于釀造優質葡萄酒。目前，新疆釀酒葡萄種植面積達213.3km2，主要分布在天山北坡和焉耆盆地。新疆現有葡萄酒加工企業40多家，張裕、王朝和長城等內地知名葡萄酒生產企業也相繼進駐新疆。據統計，2012年全疆釀酒能力達到20萬t以上，其中干紅系列葡萄酒生產規模居全國首位。在新疆多年種植葡萄的園區有多種天然酵母與其相伴而生，經長期的自然選擇，逐漸培育了一批適于當地環境條件和葡萄品種的優勢天然酵母。歐洲葡萄酒產區將優勢天然酵母分離、改性，制備成活性干酵母后用于葡萄酒生產。我國在葡萄酒酵母的研究和利用方面，與法國、美國和意大利等發達國家相比還處于起步階段，葡萄酒生產所用菌株大部分依賴進口，這已經是制約新疆葡萄酒產業發展的瓶頸因素[2]。目前，國內相繼建立了一些關于發酵利用微生物種質資源庫。但是，對新疆各個品種葡萄及其制品沒有進行系統的調查，也沒有對其加工工藝的數據資料進行整理，尤其對發酵特色葡萄酒產品中的酵母菌種質資源的系統分離、保藏和菌種庫的建立，更是空白，因此急需加強相關研究工作。

優良酵母菌種的選用是目前葡萄酒研究領域的熱點之一[3]。本文從自然發酵的赤霞珠葡萄汁中分離出的酵母菌株中篩選出發酵能力較強的優良釀酒酵母菌株Y6和Y19，初步探究了其發酵性能及SO2、酒精、高糖、酸性及溫度耐受性，以工業菌株為參照進行連續混合發酵試驗，深入探究了其進行混合發酵相關系數，此研究為提高果酒品質奠定基礎，并對豐富釀造果酒菌種資源及擴大果酒市場占有率具有重要的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株：選用實驗室保藏菌株的7種，編號分別為Y2、Y3、Y6、Y10、Y16、Y19、Y21；其系統發育樹見圖1。對照菌株：D-245，工業用菌株；本試驗所使用化學試劑均為色譜純及分析純，購于天津市巴斯夫化學試劑廠。

圖1 基于26S rDNA 序列的26株酵母菌株的系統發育Fig.1 Phylogenetic tree of 26 yeast strains based on partial 26S rDNA sequences

1.2 方法

1.2.1 耐受性試驗

分別對8株酵母菌做耐SO2性能試驗[4]、耐酒精性能試驗[5]、耐高糖濃度性能試驗[6]、耐酸性能試驗[7]、溫度耐受性能試驗[8]。

1.2.2 連續混合發酵試驗

選擇2株耐受性較好的菌株，進行連續混合發酵試驗，以感官評定為標準，確定最佳比例及最佳添加時間。感官評定標準見表1[9]。

2 結果與分析

2.1 耐受性試驗結果分析

2.1.1 耐SO2性能試驗結果

表1 自選酵母混合發酵感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standard of optional yeast mixed fermentation

分別將8種酵母菌接種在SO2質量濃度分別為200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L的酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基中培養，觀察其發酵啟動時間，從而篩選出具有良好SO2耐受性的菌株。結果見表2。

表2 SO2質量濃度對發酵啟動時間的影響Table 2 Effect of SO2concentration on fermentation starting time

葡萄酒在生產過程中需要加入適量的SO2，以達到抑制有害微生物、抗氧化、護色等作用，優良葡萄酒酵母要確保能在一定的SO2質量濃度條件下正常發酵[10]。由表2可知，當SO2濃度≥500mg/L時，各菌株不能發酵；SO2質量濃度為400mg/L時，各菌株發酵時間最短，其中Y6、Y19在同等條件下啟動發最快，表明其具有一定的耐SO2性能。

2.1.2 耐酒精性試驗結

酒精是發酵的主要產物，葡萄酒酵母比其他酵母耐受酒精的能力較高[7]，本實驗選取酒精度分別為12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol 加入YPD液體培養基中培養酵母菌，觀察其發酵啟動時間，從而確定其酒精耐受性。試驗結果如表3所示。

表3 酒精度對發酵啟動時間的影響Table 3 Effect of alcohol concentration on fermentation starting time

葡萄酒的酒精度一般為12%vol，酒精對酵母菌本身有一定的毒性，達到一定濃度時，會抑制酵母菌的生長、細胞發育以及酒精發酵的能力[11]。由表3，當酒精度≥16%vol時，各菌株均不能啟動發酵；隨著酒精度的升高，酵母菌啟動發酵的時間推遲，其中Y6、Y19株菌在同等條件下啟動發酵最快，表明其酒精耐受性較好。

2.1.3 耐高糖試驗結果

分別將8種不同酵母菌接種在葡萄糖質量濃度分別為100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L的YPD液體培養基中培養，觀察其發酵啟動時間，從而確定其耐糖性。

表4 葡萄糖質量濃度對發酵啟動時間的影響Table 4 Effect of glucose concentration on fermentation starting time

葡萄酒工業中，糖是酒精發酵的基質，也是酵母賴以生存的能源物質。但是高濃度的糖對酵母有抑制作用即葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用。而且，高滲透壓會導致酵母細胞水分流失，活性降低。此外，當培養基中糖濃度較高時，系統黏度較高，CO2釋放慢[12]。由表4可知，葡萄糖質量濃度為200～300g/L時，各菌株都能在12h 左右快速啟動發酵；當質量濃度達到400g/L 時，發酵啟動時間延遲，但各菌株之間差異不顯著；當質量濃度達到500g/L 時，只有Y6和Y19能完成發酵，其余菌株發酵則均不能完成，因此，Y16和Y19較其他菌株具有較強的耐高糖性能。

2.1.4 耐酸性試驗結果

YPD液體培養基中分別加入含量為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的檸檬酸培養，觀察其發酵啟動時間，確定其耐酸性。

表5 檸檬酸含量對發酵啟動時間的影響Table 5 Effect of citric concentration on fermentation starting time

由表5可知，在pH為3.5時，大部分酵母菌能繁殖，而細菌在pH低于3.5時停止繁殖[13]。在pH降至2.6時，一般酵母菌停止繁殖。由表5可以看出，Y6和Y19可耐受2.5%的檸檬酸含量，較其他菌株具有更強的耐酸性。葡萄通常具有一定酸度，因此耐酸的菌株更適合特色葡萄酒的釀造。

2.1.5 溫度耐受性試驗結果

葡萄酒酵母最適繁殖溫度為22～30℃。當溫度低于16℃，繁殖很慢，本實驗選取不同的培養溫度15℃、20℃、25℃、30℃培養，觀察發酵啟動時間，確定其溫度耐受性。

表6 溫度對發酵啟動時間的影響Table 6 Effect of temperature on fermentation starting time

在葡萄酒生產過程中，使用熱浸漬發酵（通常超過70℃）能改善某些葡萄酒的結構和香氣，加速反應進程，減少冷卻能耗，提高代謝率，縮短發酵周期[14]。選育優良的耐高溫菌株是實現該工藝的前提。野生釀葡萄酒酵母最適繁殖溫度是22～30℃。當溫度＜15℃，繁殖很慢。由表6可知，溫度越低，發酵啟動越慢。在同等溫度條件下，各菌株表現較為接近，其中Y19表現較優，具有較好的溫度耐受性。

2.2 連續混合發酵試驗

2.2.1 Y6和Y19連續混合發酵最佳比例確定

篩選耐受性較好的2株酵母菌菌株Y6和Y19以不同比例發酵，以工業菌株D-254作對照，發酵結束后經9名品酒員進行葡萄酒感官評定來確定最佳混合比例。由系統發育樹及菌株鑒定得出：自選酵母Y6高產甘油和酯類，Y19高產酒精酵母[15]；因此以產酒酵母發酵為主，以不同的混合比例進行發酵，發酵初期加入Y6，發酵一定時間后接入Y19。發酵結束后經9名品酒員進行葡萄酒感官評定來確定最佳混合比例，感官評定結果見表7。

表7 葡萄酒感官評定結果Table 7 Sensory evaluation result of grape wine

以混合發酵比例Y6/Y19為1∶1、1∶3、1∶5條件下試驗的感官評定結果看出Y6/Y19比例為1∶3時的葡萄酒在外觀上略低于工業菌株D-254，但其香氣、滋味評定和其典型性結果均高于D-254，因此是較合理的混合比例。故選定比例Y6/Y19=1∶3為最佳添加量。

2.2.2 Y6和Y19連續混合發酵前期和后期最佳添加時間的確定

通過對Y6和Y19單株控溫發酵試驗得出Y6起酵時間比Y19晚，在發酵第2至第4天達到發酵高峰，Y9起酵時間早，且發酵速度快，在接入后24h后達到發酵高峰，所以試驗設計在接入Y6菌株48h、54h、60h后接入Y19繼續完成全發酵過程[16]。發酵結束后測得酒樣的理化指標，根據各項指標確定最佳添加時間，結果見表8。

表8 混合發酵指標Table 8 Indicators of mixed fermentation

表9 混合發酵菌株最佳菌添加時間試驗7d后的結果Table 9 Best results mixed fermentation strains of bacteria added 7d after the time trial

由表9可知，Y6與Y19混合培養后Y6的香氣物質量比其單株發酵的香氣要略少，但最終總酯含量比D-254單株發酵提高了4.39%，且混合發酵后酒精度也比D-254有提高，所以確定54h為最佳接入時間。

3 結論

綜上所述，選育出耐受性較好的適宜釀造葡萄酒的兩株酵母菌Y6與Y19，并初步確定連續混合發酵最佳工藝條件為：前期添加酵母為Y6，發酵溫度為20℃，發酵54h；后期添加酵母Y19，發酵溫度為25℃，發酵120h，酵母總添加量為0.08%，添加比例為Y6/Y19=1∶3。

經試驗得出，選自天然赤霞珠葡萄汁中的酵母菌混合發酵發酵的葡萄酒相比其工業菌株在感官上具有較大優勢，新疆氣候、生態類型的多樣性決定了生物資源的多樣性，同時也決定了酵母菌的多樣性，新的酵母菌種資源的發現，對于釀造出具有地域特色和獨特風格的產地葡萄酒，降低新疆葡萄酒生產的成本，進而提高企業的競爭優勢有著重要意義。

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