內蒙古牧區乳酸球菌的分離鑒定及耐藥表型分析

宋曉敏，李少英 *，馬春艷，李 貞，李淑芬

（1.內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是一類發酵產物主要為乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱，具有增強免疫、防止胃黏膜病變、減輕過敏癥狀、預防腸道病原菌感染等保健功能[1]，因此在食品工業上應用廣泛。但目前工業上常用于發酵乳制品的乳酸球菌只有嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌等少數菌株[2]，急需更多的菌種來豐富發酵產品的種類。研究乳酸菌的生物多樣性可為工業生產提供更多樣、更優質的菌株選擇。內蒙古民族乳制品有著品種多、樣式廣、風味獨特等特點[3]，而其中的乳酸菌更因菌種的多樣性受到專家學者的關注。由于內蒙古民族乳制品的發酵是在自然狀態下進行的，使得其中乳酸菌的生物學特性和基因多樣性得到了很好的保留，微生物的區系組成更是牧區微生態環境的直接體現。

氟喹諾酮類藥物在臨床上廣泛應用于治療腸道感染，是腸道菌群最常接觸到的抗生素之一[4]。而乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的自然耐藥性可增強乳酸菌在腸道內的定植能力，使其免受到抗生素的干擾，為有益乳酸菌微生態制劑與氟喹諾酮類抗菌藥制劑同時使用來維持腸道正常菌群、治療腸道感染提供可能。

本實驗對內蒙古牧區民族乳制品中的乳酸球菌進行分離純化并分析菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥表型。篩選出對氟喹諾酮類藥物有抗性的菌株進行生理生化鑒定和16S rRNA序列同源性分析，旨在為今后乳酸菌進一步應用于工業化生產提供優良菌種，豐富發酵乳制品的種類；并為乳酸菌安全性研究提供實驗數據，為乳酸菌的安全應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

取自四子王旗（Siziwang Banner，SB）和達爾罕茂明安聯合旗（Darhan Muminggan，DM）牧區的自然發酵乳制品，包括酸奶和稀奶油。

1.1.2 培養基

膽鹽乳糖培養基（bile lactose，BL）培養基：1L培養基中含肝浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸粉3.0g、酵母浸粉2.0g、胰酪蛋白胨5.0g、可溶性淀粉0.5g、L-半胱氨酸0.5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1.0g、磷酸氫二鉀1.0g、大豆胨3.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉0.01g、瓊脂15.0g、硫酸錳0.006 7g、吐溫-80 1.0mL。

TPY培養基：1L培養基中含胰蛋白胨8.0g、大豆蛋白胨3.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、磷酸二氫鉀3.0g、六水合氯化鎂0.5g、氯化鈉5.0g、七水合硫酸亞鐵0.01g、吐溫80 1.0mL。

MRS培養基：1L培養基中含牛肉膏10.0g、蛋白胨10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、酵母浸膏5.0g、三水合醋酸鈉5.0g、檸檬酸二銨2.0g、吐溫-80 1mL、鹽液A（七水合硫酸鎂11.5g、四水合硫酸錳2.8g、蒸餾水1 000mL）5mL、葡萄糖20.0g。

雙料MRS培養基：1L培養基中含牛肉膏20.0g、蛋白胨20.0g、磷酸氫二鉀4.0g、酵母提取物10.0g、三水合醋酸鈉10.0g、檸檬酸二銨4.0g、吐溫-80 2mL、鹽液A 10mL（七水合硫酸鎂11.5g、四水合硫酸錳2.8g、蒸餾水1 000mL）、葡萄糖40.0g。

葡萄糖酵母膏蛋白胨（glucose yeast extract peotone，GYP）培養基：1L培養基中含葡萄糖20.0g、酵母提取物10.0g、蛋白胨10.0g、三水合醋酸鈉5.0g、吐溫-80 10mL、鹽液（七水合硫酸鎂40.0g、四水合硫酸錳2.0g、七水合硫酸亞鐵2.0g、氯化鈉2.0g、蒸餾水1 000mL）5mL。

1.1.3 抗生素標準品

實驗所用抗生素標準品具體情況見表1。

表1 抗生素標準品的名稱、生產批號及來源Table 1 Name,batch number and source of antibiotic standards

1.1.4 菌株

質控菌株為大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922：美國典型培養物保藏中心。

標準菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CICC 23658：中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.5 試劑

新型微量生化管：廣東環凱微生物科技有限公司；細菌DNA基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×EasyTaqSuper Mix：TRANS；DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer、核酸染料：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖：美國Sigma公司。

1.1.6 16s rRNA擴增引物

F：agagtttgatcctggctcag，R：aaggaggtgatccagcc，目的產物大小約為1 500bp。參照文獻[6]所提供的引物。

1.2 儀器與設備

350mL厭氧培養袋：青島海博生物技術有限公司；SPX-1500型恒溫恒濕培養箱：上海博訊實業有限公司；OLYMPOSBX50型光學顯微鏡：日本OLYMPOS公司；FLC-3型超凈工作臺：哈爾濱市東聯公司；快速梯度PCR儀：美國ABI公司；DYCP-31DN型電泳儀：北京市六一儀器廠；圖像記錄分析儀：普洛麥格（北京）生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸球菌的分離純化及保存

用劃線法對樣品中的乳酸球菌進行分離及純化。對分離純化得到的菌株進行真空冷凍干燥保存，方法參照文獻[7]。

1.3.2 分離菌株的初步鑒定

對分離菌株進行初步鑒定以確定其為乳酸球菌，鑒定內容包括革蘭氏染色并鏡檢、過氧化氫酶試驗和脫脂乳發酵試驗。

1.3.3 試驗菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥性測定

用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將3種氟喹諾酮類藥物的抗生素標準品按照美國臨床和實驗室標準協會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）的耐藥標準進行溶解，制備成高濃度的抗生素貯存液，-20℃保存。按照二倍稀釋法將抗生素貯存液進行稀釋，設定藥物質量濃度為800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL。

在無菌條件下將試驗菌株接種于MRS液體培養基中，傳代培養3代，并用空培養基稀釋3代菌液至活菌數為107CFU/mL。按6%的接菌量接種于雙料MRS液體培養基中混勻，并加入到等體積稀釋好的藥物中。設置培養基空白、菌空白、藥物空白作為對照。37℃培養24h，用目視比濁法觀察并記錄最小抑菌濃度（MIC）。參照CLSI藥敏判斷標準中腸球菌屬MIC解釋標準對結果進行判讀[8]，做3次重復試驗，解釋判讀標準見表2。

表2 腸球菌屬MIC解釋標準Table 2 MIC interpretation standards of Enterococcus

1.3.4 試驗菌株的生理生化鑒定

試驗菌株活化培養3代，按照文獻[9]的方法進行葡萄糖產氣試驗、溫度生長試驗、pH生長試驗、耐鹽試驗、精氨酸產氣試驗、發酵蔗糖產葡聚糖試驗、糖發酵試驗。

1.3.5 試驗菌株的16S rRNA序列擴增及分析

將活化培養的第3代菌液，用細菌基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA的提取。對試驗菌株的16S rRNA序列進行擴增，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系為50μL，其中2×EasyTaqSuper Mix 25μL、上下游引物各2μL、模板DNA 2μL、剩余無菌水補足。PCR循環參數為94℃預變性3min，94℃變性30s，57.4℃退火30s，72℃延伸90s，72℃末端延伸5min，35個循環。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物測序，所得序列拼接后用美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上的基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對其同源性進行分析，并用DNAstar軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 分離菌株初步鑒定

初步鑒定結果顯示，試驗菌株均為革蘭氏陽性球菌，且過氧化氫酶陰性，發酵脫脂乳陽性，可初步判定為乳酸菌。

2.2 試驗菌株的耐藥表型

2.2.1 試驗菌株MIC測定結果

試驗菌株的MIC測定結果如表3所示，MIC1、MIC2、MIC3分別為3次重復試驗的測定結果。

由表3可知，對3種氟喹諾酮類藥物顯示耐藥的試驗菌株的MIC大部分超出了試驗可測定的最大值400 μg/mL，試驗菌株呈現高度耐藥。

表3 試驗菌株MIC測定結果Table.3 MIC determination results of tested strains

2.2.2 試驗數據重復性分析

由于MIC測定所得數據非正態分布，故先將數據取對數使其符合方差分析的數據要求（＞400 μg/mL按800 μg/mL計，＜0.78 μg/mL按0.78 μg/mL計）。用SPSS軟件對取對數后的MIC數據進行方差分析，以檢測試驗數據的重復性，18株試驗菌株對3種氟喹諾酮類藥物的平均標準差、均值、變異系數如表4所示。

表4 試驗數據標準差及變異系數Table 4 Standard deviation and variation coefficient of experimental data

由表4方差分析結果可知，3種氟喹諾酮類藥物藥物的MIC測定的變異系數（coefficient of variation，CV）均＜8%，試驗重復性良好，結果可反映18株試驗菌株的真實耐藥情況。

2.2.3 試驗菌株對抗生素的耐藥結果判定

參照CLSI藥敏判斷標準中腸球菌屬MIC解釋（見表2），對18株試驗菌株及質控菌株（大腸埃希氏菌）的MIC結果進行判讀，結果如表5所示。

表5 試驗菌株的耐藥結果Table 5 Drug resistance of tested strains

由表5可知，除DM22和DM32外的其他試驗菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星3種抗生素均呈現耐藥。DM22對3種抗生素均為中介；DM32對左氧氟沙星和環丙沙星敏感，對諾氟沙星為中介。試驗菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星的耐藥率均高達88.9%。

2.3 耐藥菌株的生理生化鑒定

篩選出對3種抗菌藥的MIC均＞400 μg/mL（所設定的最高濃度）的菌株SB4、SB26、DM33、DM41 及對3種抗菌藥都處于中介的菌株DM22。對這5株菌進行生理生化鑒定，鑒定結果如表6、表7所示。

由表6可知，5株試驗菌株均為同型發酵，在10℃和45℃均可生長，SB4、SB26、DM41在50℃也可生長；5株試驗菌株在酸性（pH4.8）和堿性（pH9.6）條件下均可生長，耐6.5%的NaCl，均能分解精氨酸產氨氣，其中DM22和DM33可發酵蔗糖產微量的葡聚糖。

表6 耐藥菌株的生理生化鑒定結果Table 6 Physiological and biochemical identification results of drug resistant strain

表7 糖發酵結果Table 7 Sugar fermentation results

由表7可知，5株耐藥菌株均可發酵果糖和乳糖，此外，SB4、SB26、DM41還能發酵棉籽糖和阿拉伯糖。

根據文獻[9]中的兩歧法對試驗菌株的屬種進行判定，SB4、SB26、DM41 初步判定為屎腸球菌（Enterococcus faecium），DM22、DM33初步判定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），同時標準菌株CICC23658判定為糞腸球菌。

2.4 耐藥菌株16S rRNA序列同源性

提取得到的試驗菌株基因組總DNA經電泳檢測，條帶遠大于2 000bp，符合試驗預期。PCR產物電泳圖見圖1。由圖1可知，產物條帶約為1 500bp，與文獻中該引物所擴增的目的產物大小相同。

圖1 16S rRNA基因PCR產物電泳檢測Fig.1 Electrophoresis detection of 16s rRNA gene PCR product

5株試驗菌株和標準菌株的16S rRNA序列與GenBank中已知菌株的基因序列進行同源性比對，系統發育樹見圖2。

圖2 試驗菌株與其他乳酸菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of tested strains and other lactic acid bacteria

圖2結果表明，SB4、SB26、DM41與屎腸球菌同源性最高，由此可判定這3株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。DM22、DM33與堅強腸球菌同源性均高達99.4%，由此可判定DM22和DM33都為堅強腸球菌（Enterococcus durans），與生化鑒定結果有出入，可能的原因是生化鑒定不能有效鑒別部分親緣關系近的菌種。同時，標準菌株CICC23658與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）同源性為99.9%，說明試驗結果可信。

3 討論

腸球菌是人和動物腸道中的正常菌群，廣泛存在于乳制品和發酵食品中[10-12]。據有關文獻報道，在歐洲國家已有十多株腸球菌被允許用于食品中[13]，隨著微生態學理論的發展，腸球菌也可越來越多地用于微生態制劑的生產。另外，屎腸球菌和堅強腸球菌都可產生具有抑菌作用的腸球菌素[14]。因此，在腸球菌進行安全性評價的基礎上，將其應用于乳制品、肉制品的發酵已成為發酵劑開發和研究的熱點。

目前研究認為，細菌耐藥性一般可以大致分為2種：一是固有性耐藥，二是獲得性耐藥。固有性耐藥一般不會發生轉移；但獲得性耐藥菌株容易發生耐藥基因的轉移，可能轉移到其他乳酸菌或致病菌中[15]。因此，研究耐藥菌株是否為獲得性耐藥對耐藥菌株今后的安全應用顯得尤為重要。自然發酵乳中的乳酸菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥性的原因，以及會不會發生轉移都有待進一步研究證實。

4 結論

從自然發酵乳中分離初步鑒定為乳酸菌的18株球菌對左氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星呈現不同程度的耐藥，耐藥率均高達88.9%。對篩選出的4株高度耐藥和1株中介菌株進行生理生化鑒定和16S rRNA序列同源性分析，鑒定結果顯示SB4、SB26、DM41為屎腸球菌（Enterococcus faecium），DM22、DM33為堅強腸球菌（Enterococcusdurans）。

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