殼聚糖與DNA相互作用的單分子方法研究

張旭，王艷偉，楊光參

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

DNA凝聚是將一根或幾根自由伸長的DNA凝聚成緊湊、有規律形態的過程，是基因治療的重要組成部分［1］。因聚合物的尺寸及分散性對基因治療效果有很大的影響，所以凝聚劑的選擇尤為重要［2－4］。殼聚糖是一種天然的高分子，具有優良的生物相容性、生物可降解性、低毒以及高正電荷的性質，所帶的陽離子可以與DNA上的陰離子有效結合，并且保護其免受核酸酶的降解，以保障DNA所受的破壞最小，同時裝載DNA的殼聚糖微粒性質比較穩定［1，5－13］。這些特點使得殼聚糖被廣泛應用在生物醫學的很多領域中，如制藥、組織工程和基因傳遞等［11－15］。

目前對殼聚糖的研究很多，Stranad等［16］通過實驗證明了殼聚糖凝聚DNA的能力與乙?；瘑挝缓考熬酆隙染o密相關，即環狀與棒狀聚合物的比，隨著乙?；瘑挝缓康脑黾佣档?，同時證明了殼聚糖的電荷密度是決定聚合物形態的重要因素。Liu等［17］排除乙酰基對殼聚糖與DNA相互作用的影響，用CD光譜、靜電熒光和原子力顯微鏡(AFM)等方法研究在不同殼聚糖與DNA電荷比k下，殼聚糖－DNA聚合物的形態學特征，并驗證了其穩定性與pH值緊密相關。Cao等［18］進一步驗證了上述結論，即pH值為5時聚合物是穩定存在的，當pH值上升到9時，凝聚態的DNA被釋放出來。Strand等［16］也通過研究證實了殼聚糖的電荷密度及每條鏈上的電荷數是聚合物形態的決定因素，同時也驗證了當pH值大于7.4時聚合物的穩定度下降，這就為基因治療中生理pH值附近的聚合物穩定度降低提供了理論依據。

單分子磁鑷(magnetic tweezers，MT)、AFM等技術的迅速發展使我們能夠深入地研究生物大分子的一些特性，實時觀測單分子的運動軌跡，通過對這些分子機械性能的研究，使我們了解它們在細胞內的作用機制。因此，單分子技術對了解DNA凝聚及分子性質有很大的幫助。應用問題可以在單根DNA分子上施加一個恒定的力，同時測量它的長度隨時間的變化，進而對其作用過程得以深入地了解［19－21］。本文我們采用AFM及MT技術，系統地研究了殼聚糖作用下的DNA凝聚。用AFM技術對聚合物形態及尺寸隨電荷比k的變化規律進行統計，然后應用MT技術觀察凝聚力及拉伸步距隨k值的變化規律，并進一步研究其相互作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

實驗選用的噬菌體λ－DNA及bpr322－DNA購自New England Biolabs公司，原始濃度是500 ng/μL，使用前無需提純。純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)經密理博超純化系統去離子，紫外滅菌處理。殼聚糖、MgCl2及配置殼聚糖溶液所使用的NH4AC及乙酸均購自美國Sigma公司。殼聚糖用分1%乙酸溶液稀釋至1 mg/mL作為母液，后期用150mmol/L NH4AC(pH=7.4)稀釋到不同濃度。

圖1 橫向單分子MT裝置Fig.1 Horizontal single molecule MT device

1.2 MT實驗裝置及方法

本實驗采用橫向單分子MT裝置(圖1A)，首先將0.17 mm厚的蓋玻片一側磨光，然后夾到兩個載玻片中間，四周用玻璃膠密封，形成一個流動的密封槽，兩邊接兩個玻璃微管，用于導入及導出緩沖液與藥品等。樣品槽放到倒置顯微鏡的40倍物鏡上面觀察，用三維操縱儀控制順磁鐵對焦平面上的DNA施加力。事先磨光的蓋玻片的側壁涂有抗地高辛與DNA一端的地高辛連接。當DNA與磁球的混合液沖入樣品槽后，就會形成側壁－DNA－順磁球的結構(圖1B)。導入試劑的樣品槽在室溫下垂直靜止放置半小時，放置過程中應確保磨光的蓋玻片表面向上，確保DNA分子連接到磨光的側壁上。然后用緩沖液沖洗，去除多余的未連接在側壁上的DNA分子，確保實驗過程視野清晰。用顯微鏡找到連接好的DNA分子，觀察并錄像。通過測量磁球與蓋玻片側壁之間的距離得到DNA的長度，通過磁球在垂直于DNA伸長方向上的布朗運動得到DNA所受的拉力［20，22－23］。其磁力可表示為。

其中KB為玻爾茲曼常量，T為熱力學溫度，δx為磁球布朗運動x方向的均方差。

通過分析軟件分析力與長度的關系，對比已知數據來確定是否為單根DNA。根據不同的k值計算出殼聚糖濃度，用1 mg/mL的殼聚糖作為母液，并用150mmol/L NH4AC(pH=7.4)稀釋到所需要的濃度并注入到樣品槽里面，培養15 min后，觀察不同k值下DNA的長度隨時間的變化關系。

1.3 AFM實驗裝置及方法

實驗裝置為日本京都島津公司生產的AFM，型號為SPM－9600。AFM在空氣中掃描圖像采用輕敲模式獲得。掃描速度為3 Hz，均方振幅是2 V，驅動頻率約350 kHz，硅探針具有42 N/m的固定彈性系數，圖片像素512×512。首先按不同的k值計算出100 μL溶液所需的DNA的量(實驗中所使用的DNA的濃度均為原始濃度)。取出DNA后放入離心管中，按計算所得加入殼聚糖溶液后，用NH4AC溶液稀釋，最終保證DNA的濃度恒定為4 ng/μL備用。實驗時，用移液器取出15 μL的DNA－殼聚糖混合液滴到新鮮剝離的云母片表面上，靜置2～3 min，然后用20 μL的Milli－Q超純水沖洗云母片，大約沖洗10～15次，最后用氮氣吹干樣品，將樣品在干燥器中保存2 h以上待用。

2 結果與討論

應用MT技術研究不同k值下DNA在殼聚糖作用下的凝聚過程及凝聚力的變化，并得出其變化的規律。應用AFM技術觀察不同種類的DNA在相同k值下聚合物的形態學上的區別，同時觀察同種DNA在不同k值下的形態學的變化規律并與MT結果相對照，進而深入地了解DNA在殼聚糖作用下的凝聚過程。

2.1 用MT研究λ－DNA的力譜變化

殼聚糖是目前常用的基因治療的載體，我們利用MT技術研究不同濃度的殼聚糖作用下的λ－DNA的力譜曲線變化。在恒定外力作用下，沒有加入任何藥品時λ－DNA的長度是不隨時間變化的，即DNA的長度在恒力作用下保持不變，只有本身布朗運動引起的微小長度變化。而在溶液中加入k=2的相應濃度的殼聚糖后，我們會觀測到λ－DNA的凝聚過程。因凝聚過程中控制外力難以恒定，而拉伸過程中可有效地克服此缺點，所以我們選取拉伸曲線為研究對象。控制外力為5.9 pN，觀測λ－DNA的拉伸過程(圖2)，從側面證明了在殼聚糖的作用下DNA發生了折疊及凝聚。另外，殼聚糖濃度較小且施加在DNA上的外力很大時，也會發現λ－DNA的長度有所收縮，證明殼聚糖對λ－DNA的作用比較強。

圖2 k=2時，加入殼聚糖后DNA的長度與時間關系曲線Fig.2 Extension－time curve ofthe DNA corresponding to k=2 after chitosan adding

圖3 k=4時，加入殼聚糖后DNA的長度與時間關系曲線Fig.3 Extension－time curve ofthe DNA corresponding to k=4 after chitosan adding

圖3給出了k=4時殼聚糖－DNA聚合物在5.9 pN的恒力作用下的拉伸曲線，與圖2比較可知，當k值增大時拉伸曲線中大跳躍步距明顯增多，且初始階段的長度變化趨勢明顯加快。這可能是因為隨著k值的增加，DNA凝聚得更加緊湊且凝聚的節點增多，因而被拉伸的機會也相應地增加。而當k=2或k=4時均發現有500 nm左右的大步距存在，這可能是因為DNA在凝聚過程中形成的幾個環狀結構同時被打開造成的。

2.2 用AFM研究殼聚糖與不同類型DNA的作用

配制不同濃度的殼聚糖溶液，按不同的k值與環狀pbr322－DNA混合，制成AFM樣品進行觀察，發現聚合物的形態隨著k值的變化而明顯變化，圖4是不同k值下，殼聚糖與環狀pbr322－DNA分子相互作用的AFM圖像。圖4A為沒有加入任何藥品的環狀pbr322－DNA分子的AFM圖像，當沒有與藥物分子相互作用時，DNA成圓環狀結構。圖4B～D分別對應k值為2、5、6時，加入殼聚糖后的DNA圖像，從中可發現DNA發生凝聚，而且有環狀、棒狀及球狀結構出現。當k值不斷增加時，球狀和棒狀結構的比值不斷減小，且凝聚物的尺寸也逐漸變小。由統計結果可知在k值由2增加到6時，球狀與棒狀聚合物的比由2減小到0.75。此部分結果與前人實驗所得結果基本一致［24］。

圖4 環狀pbr322－DNA分子的AFM圖像及不同k值下的殼聚糖與環狀pbr322－DNA分子相互作用的AFM圖像。Fig.4 AFM imageofcirclepbr322－DNA molecules and AFM images of the interaction between circle pbr322－DNA and chitosan

圖5 線狀λ－DNA分子以及不同k值下的殼聚糖與線狀λ－DNA分子相互作用的AFM圖像Fig.5 AFM image of linear λ－DNA molecules and AFM images of the interaction between linear λ－DNA and chitosan

為了深入地研究DNA與殼聚糖的相互作用的過程，我們變換DNA的種類，研究殼聚糖與線狀λ－DNA分子的相互作用。圖5 A是裸λ－DNA的AFM圖像，DNA處于自由伸展狀態。向λ－DNA溶液里面加入殼聚糖，當k值=0.5時，線狀λ－DNA分子明顯聚集并出現凝聚的棒狀及球狀結構，當k值繼續增大時，λ－DNA聚集得更加緊湊，旁邊的松散結構全部消失并出現了環狀聚合物，在k值增大的過程中聚合物的尺寸也在逐漸地減小(如圖5 B ～D k值分別為0.5、2、4。).

通過比較圖6與圖7，我們發現對于不同DNA凝聚物的球狀與棒狀結構比隨k值的變化規律基本是相同的，即都是隨著k值的增加而降低。同時發現相同的k值下，使用pbr322－DNA比使用λ－phage DNA形成的粒子分散性好，且形成的粒子的尺寸基本相同。在MT實驗中我們選用線性λ－phage DNA代替pbr322進行實驗，以便于實時地觀測殼聚糖與DNA的作用過程，對其相互作用有較為深入地了解。

圖6 pbr322－DNA－殼聚糖聚合物的球狀/棒狀比值隨著k值變化的統計圖Fig.6 Illustration of the variety of torod/rad ratio of pbr322－DNA－chitosan polymer with k

圖7 λ－phage DNA－殼聚糖聚合物的球狀/棒狀比值隨著k值變化的統計圖Fig.7 Illustration of the variety of spherical/rad ratio of λphage DNA－chitosan polymer with k

3 殼聚糖與DNA作用的模型簡圖

圖8將DNA在殼聚糖作用下所形成聚合物的形態以直觀的方式表示出來，即DNA在殼聚糖的作用下所形成的聚合物的形態主要以環狀、棒狀和球狀為主，同時也會有一些不規則形態的聚合物存在。而且隨著k值的不同，各形態粒子之間的比例明顯的不同。原因可能是殼聚糖通過與DNA的堿基對結合，使DNA折疊和凝聚。

圖8 DNA與殼聚糖作用的模型圖Fig.8 Model image of the interaction between λ－DNA and chitosan

4 結論

本文應用AFM及MT技術研究了殼聚糖與不同種類的DNA的相互作用過程，并對電荷比k取不同值時，DNA的凝聚過程及所形成聚合物的形態進行了統計。DNA與殼聚糖相互作用所形成聚合物的形態由初始時的不規則塊狀慢慢凝聚成具有規則形態的聚合物，其中包括球狀、環狀及棒狀，且由統計結果可知，球狀或環狀與棒狀聚合物的數量之比隨著k值的增加而不斷地降低。同時，聚合物的尺寸也隨著k值的增加逐漸地減小。通過MT實驗可知，隨著k值的不斷增加，DNA的凝聚過程所需的時間越來越短，即長度隨時間的變化越來越明顯。

［1］BLOOMFIELD V A.DNA condensation［J］.Current opinion in structural biology，1996，6(3):334 －341.

［2］PELTA J Jr，DURAND D，DOUCET J，et al.DNA mesophases induced by spermidine:Structural properties and biological implications［J］.Biophysical journal，1996，71(1):48 －63.

［3］RASPAUD E，DURAND D，LIVOLANT F.Interhelical spacing in liquid crystalline spermine and spermidine－DNA precipitates［J］.Biophysical journal，2005，88(1):392 －403.

［4］HUD N V，VILFAN I D.Toroidal DNA condensates:Unraveling the fine structure and the role of nucleation in determining size［J］.Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，2005，34:295－318.

［5］LANKALAPALLI S，KOLAPALLI V.Polyelectrolyte complexes:A review of their applicability in drug delivery technology［J］.Indian journal of pharmaceutical sciences，2009，71(5):481 －487.

［6］NARAMBUENA C F，LEIVA E P M，CHáVEZ－PáEZ M，et al.Effect of chain stiffness on the morphology of polyelectrolyte complexes.A Monte Carlo simulation study［J］.Polymer，2010，51(14):3293 －3302.

［7］ALATORRE－MEDA M，TABOADA P，SABíN J，et al.DNA－chitosan complexation:A dynamic light scattering study［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，2009，339(1/2/3):145－152.

［8］IVANOV V A，MARTEMYANOVA J A，MüLLER M，et al.Conformational changes of a single semiflexible macromolecule near an adsorbing surface:A Monte Carlo simulation［J］.The Journal of Physical Chemistry B，2009，113(12):3653 －3668.

［9］CUI Z，MUMPER R J.Chitosan－based nanoparticles for topical genetic immunization［J］.Journal of controlled release，2001，75(3):409－419

［10］ILLUM L，JABBAL－GILL I，HINCHCLIFFE M，et al.Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines［J］.Advanced drug delivery reviews，2001，51(1/2/3):81 －96

［11］SALAS T，MARTíNEZ B P，GODíNEZ R R T，et al.Evaluation of humoral and cellular immune response in amurine model using vesicles outer membrane of Brucella ovis in chitosan nanoparticles［J］.Asian Chitin Journal，2008，4:59－66.

［12］JAYAKUMAR R，NWE N，TOKURA S，et al.Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2007，40(3):175 －181.

［13］KAI E，OCHIYA T.A method for oral DNA delivery with N－acetylated chitosan［J］.Pharmaceutical research，2004，21(5):838－843

［14］PURAS G，ZARATE J，ACEVES M，et al.Low molecular weight oligochitosans for non－viral retinal gene therapy［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2013，83(2):131－140.

［15］BLOOMFIELD V A.DNA condensation by multivalent cations［J］.Biopolymers，1997，44(3):269 －282.

［16］STRAND S P，DANIELSEN S，CHRISTENSEN B E，et al.Influence of chitosan structure on the formation and stability of DNA－chitosan polyelectrolyte complexes［J］.Biomacromolecules，2005，6(6):3357 －3366.

［17］LIU W G，SUN S J，CAO Z Q，et al.An investigation on the physicochemical properties of chitosan/DNA polyelectrolyte complexes［J］.Biomaterials，2005，26(15):2705 －2711

［18］CAO W D，EASLEY C J，FERRANCE J P，et al.Chitosan as a polymer for pH－induced DNA capture in a totally aqueous system［J］.Analytical chemistry，2006，78(20):7222－7228.

［19］SUN B，WEI K J，ZHANG B，et al.Impediment of E.coli UvrD by DNA－destabilizing force reveals a strained－inchworm mechanism of DNA unwinding［J］.The EMBO Journal，2008，27(24):3279 －3287.

［20］ RAN SY，WANG Y W，YANG G C，etal. Morphologycharacterizationandsingle－moleculestudyofDNA－dodecyltrimethylammonium bromide complex［J］.The Journal of Physical Chemistry B，2011，115(16):4568 －4575.

［21］RICHARDSON S W，KOLBE H J，DUNCAN R.Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system:Biocompatibility，body distribution and ability to complex and protect DNA［J］.International journal of pharmaceutics，1999，178(2):231－243.

［22］WANG Y W，RAN S Y，MAN B Y，et al.Ethanol induces condensation of single DNA molecules［J］.Soft Matter，2011，7(9):4425－4434.

［23］STRICK T R，ALLEM J－F，BENSIMON D，et al.Behavior of supercoiled DNA［J］.Biophysical journal，1998，74(4):2016 －2028.

［24］DANIELSEN S，V?RUM K M，STOKKE B T.Structural analysis of chitosan mediated DNA condensation by AFM:Influence of chitosan molecular parameters［J］.Biomacromolecules，2004，5(3):928 －936.