天麻素分子印跡聚合物的吸附和識別性能研究

陳凌霄，馬秀麗，王曉，耿巖玲，高乾善，謝宏凱，紀(jì)文華*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山東 泰安 271000;2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

分子印跡聚合物(MIPs)是指目標(biāo)分子(模板分子)、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和致孔劑在特定條件下高度交聯(lián)聚合，然后脫除模板而得到的聚合物，在形狀和結(jié)構(gòu)上保留與模板分子相匹配的空穴，因而能夠選擇性地識別、結(jié)合模板分子。MIPs擁有諸多優(yōu)點，如選擇性強、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對環(huán)境的耐受性好、可重復(fù)利用和制備簡單等，因此已逐漸成為化學(xué)和生物領(lǐng)域的研究熱點［1－4］，在中藥提取與分離領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

天麻素為我國傳統(tǒng)中藥材天麻的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠，抗驚厥、鎮(zhèn)痛、抗癲癇，保護神經(jīng)細(xì)胞等作用，在臨床上多用于眩暈、頭痛及高血壓的輔助治療，效果顯著［5－7］。現(xiàn)在提取和純化天麻中的天麻素，主要依靠大孔吸附樹脂、高效液相色譜(HPLC)以及高速逆流色譜(HSCCC)等手段［8－11］。由于這些技術(shù)的固定相對天麻素缺乏選擇性，導(dǎo)致分離過程長、有機溶劑消耗量大以及環(huán)境污染嚴(yán)重。因此，研究開發(fā)對天麻素有選擇性吸附效果的填料意義重大。

在之前的研究中，He等［12］以酸性功能單體甲基丙烯酸(MAA)成功合成了天麻素表面分子印跡聚合物，并對其進行了表征。本研究室使用新型功能單體 2，3，4，6-tetra-O-acetyl-glucopyranoside 和 1，2，3，4，5-pentafluoro-6-vinylbenzene成功合成了天麻素分子印跡聚合物，并將其用作固相萃取柱填料來提取天麻中的天麻素［13］。本文使用堿性功能單體4-vp來合成天麻素分子印跡聚合物，并對其吸附性能和識別性能進行研究。

1 實驗部分

1.1 實驗設(shè)備和材料

SWPRATM55型電子顯微鏡，德國卡爾蔡司公司。天麻素(≥98%)由西安冠宇生物技術(shù)有限公司提供，4-乙烯基吡啶(4-vp)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)采購自阿拉丁試劑公司。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為去離子二次蒸餾水。

1.2 MIPs的制備

在10mL 試管中加入0.5 mmol天麻素，1.0mmol功能單體4-vp，4.0mmol EGDMA，10mg AIBN 和2 mL二甲亞砜(DMSO)，超聲脫氣15 min，然后充入氮氣15 min，密封。將密封后的試管于60℃下聚合24 h，所得聚合物碾磨后過200目篩，收集過篩后的聚合物并將其放入索氏提取器中，用甲醇:乙酸(V:V)=9:1的溶液提取24 h除去模板分子，再用甲醇洗脫除去乙酸，聚合物顆粒經(jīng)丙酮反復(fù)沉降，除去細(xì)顆粒后，真空干燥24 h，即得天麻素分子印跡聚合物。空白印跡聚合物(NIPs)的制備過程中不添加天麻素，其余同上。

1.3 掃描電鏡分析

為了研究分子印跡聚合物的表面結(jié)構(gòu)特性，對MIPs和NIPs進行掃描電鏡分析，放大倍數(shù)為10000倍。

1.4 平衡吸附實驗

稱取10mg MIPs置于離心管中，加入2.5 mL不同濃度的天麻素水溶液(0.05～0.5 mmol/L)，在室溫下震蕩4 h后，高速離心15 min，取上清液并用HPLC檢測其中天麻素的含量。同時平行做NIPs對天麻素的平衡吸附實驗。吸附量Qe的計算公式為

Langmuir模型(2)和Freundlich模型(3)用來評價MIPs的吸附特性。

式中，Qe為吸附平衡時MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，Ci為天麻素水溶液的初始濃度(mmol/L)，Ce為吸附平衡時天麻素水溶液的濃度(mmol/L)，qm為理論最大吸附量，KL為Langmuir平衡常數(shù)，KF為吸附劑吸附能力常數(shù)，n為Freundlich常數(shù)，n＞1.0表示有利于吸附。

1.5 吸附動力學(xué)實驗

為了考察MIPs對天麻素的吸附速率，在10mg MIPs中加入0.1 mmol/L的天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，在室溫下震蕩10～240min后，高速離心15 min，取上清液用HPLC檢測其中天麻素的含量。Lagergren準(zhǔn)一級和二級動力學(xué)方程用來分析整個吸附進程。

Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程

Lagergren準(zhǔn)二級動力學(xué)方程

式中，Qe為吸附平衡時MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，Qt為 t時刻MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，k1為Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程的吸附速率常數(shù)(min－1)，k2為Lagergren準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的吸附速率常數(shù)(g/(mg·min))。

1.6 選擇性實驗

為了驗證MIPs對模板的選擇性，將10mg MIPs和NIPs分別置于2.5 mL 0.1 mmol/L的天麻素和葡萄糖的水溶液中，在室溫下震蕩6 h后，高速離心15 min，取上清液用HPLC檢測其中天麻素和葡萄糖的含量。

1.7 HPLC 條件

Agilent 1120高效液相色譜儀用于檢測天麻素和葡萄糖的含量。天麻素的檢測條件:色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 ×250mm)，流動相乙腈:水(3:97，V/V)，流速 1.0mL/min，進樣量 20 μL，檢測器UV 270 nm，天麻素保留時間8.40min。葡萄糖的檢測條件:色譜柱Inertsil NH2(5 μm，4.6×250mm)，流動相乙腈:水(75:25，V/V)，流速 1.0mL/min，進樣量20 μL，檢測器 UV 270 nm，葡萄糖保留時間11.2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的制備

圖1 天麻素、4-vp和葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of gastrodin，glucose and 4-vp

在MIPs的制備過程中，模板分子與功能單體要能夠相互作用并形成結(jié)合基團，才能使形成的識別空穴與模板分子有較高的匹配程度。因此，選擇合適的功能單體至關(guān)重要。4-vp(圖1)是一種堿性功能單體，常用在酸性模板分子的聚合中，而且它還是一個良好的氫受體，能夠通過氫鍵、離子鍵與模板分子中的羥基或羧基發(fā)生相互作用。本次實驗4-vp被選作功能單體。

合適的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑配比能夠提高MIPs的吸附效果，本次實驗對三者的配比進行了優(yōu)化，不同配比的平衡吸附量Qe和印跡因子α(α=Qe(MIPs)/Qe(NIPs)如表1所示。MIPs的吸附量隨著功能單體用量的增加而增加，但是NIPs的吸附量也會顯著增加。這可能是因為功能單體的增加使得聚合中存在過量的功能基團，進而使聚合物的非特異性吸附量增加。當(dāng)三者比例為1:4:8時，印跡因子 α值最高，因此選擇該比例來合成MIPs和NIPs。

表1 不同的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑配比對平衡吸附量Qe及印跡因子α值的影響Table 1 Impacts of different template molecules，functional monomer and cross-linker ratio on equilibrium absorption capacity Qeand imprinting factor α

2.2 掃描電鏡分析

對MIPs和NIPs進行了掃描電鏡分析，結(jié)果見圖2。從MIPs和NIPs的掃描電鏡圖中可以看出，MIPs表面相對于NIPs更加粗糙多孔，這可能是由于MIPs在洗脫出模板后保留了大量與模板分子相匹配的孔穴，而NIPs沒有加入模板因此形成的孔穴較少。

2.3 平衡吸附實驗

圖3為室溫下MIPs和NIPs對天麻素的吸附等溫線。MIPs和NIPs的吸附量都隨著天麻素濃度的增加而增加，但是MIPs的吸附量遠(yuǎn)高于NIPs。由于NIPs的吸附作用為非特異性吸附，因此MIPs比NIPs吸附量大可以認(rèn)為是MIPs中存在特異性更強的結(jié)合位點。

圖2 MIPs和NIPs掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of MIPs and NIPs

圖3 MIPs和NIPs的吸附等溫線Fig.3 Absorption isotherm curves of MIPs and NIPs

圖4 MIPs和NIPs的Langmuir線性擬合圖Fig.4 Langmuir isotherm linear fitting curves of MIPs and NIPs

Langmuir模型和Freundlich模型是描述吸附過程的經(jīng)典模型，以Ce/Qe對Ce根據(jù)Langmuir模型擬合作圖(圖 4)，得到 MIPs 方程式 y=0.104x+0.0732，R2=0.873，NIPs 方程式 y=0.0784x+0.191，R2=0.701。以ln Qe對 ln Ce根據(jù)Freundlich模型擬合作圖(圖5)，得到MIPs方程式y(tǒng)=0.805x+2.023，R2=0.996，NIPs方程式 y=0.946x+1.480，R2=0.997。由于 Freundlich 模型比 Langmuir模型有更高的線性相關(guān)性，因此選用Freundlich模型對數(shù)據(jù)進行分析。Freundlich模型適用于聚合物有多個不同吸附位點的情況，F(xiàn)reundlich常數(shù)n＞1說明聚合物中存在不同的結(jié)合位點并且n越大聚合物中不同的吸附位點越多。本次實驗MIPs和NIPs的n值分別為1.24和1.06，說明MIPs存在多種不同的結(jié)合位點而NIPs的結(jié)合位點相對單一。

圖5 MIPs和NIPs的Freundlich線性擬合圖Fig.5 Freundlich isotherm linear fitting curves of MIPs and NIPs

2.4 吸附動力學(xué)實驗

圖6為MIPs對天麻素的吸附動力學(xué)曲線。從圖中可以看出，MIPs對天麻素的吸附量隨時間的增加而呈上升趨勢，在吸附開始的30min內(nèi)尤為明顯(吸附量為平衡吸附量的88.38%)，50min后吸附趨于平緩，在100min時基本達到平衡。這可能是因為MIPs內(nèi)部的孔穴分布不均勻、深淺不同。在吸附開始時，淺層的孔穴快速吸附天麻素使得吸附速率快速增加，深層的孔穴由于空間位阻的影響使得吸附速率降低并最終達到平衡。

運用Lagergren準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程對天麻素MIPs不同時間的吸附數(shù)據(jù)進行擬合(圖7)，得到準(zhǔn)一級動力學(xué)方程為y= －0.0359x－ 1.109，R2=0.943，準(zhǔn) 二 級 動 力 學(xué) 方 程 為y=1.156x+8.020，R2=0.999，吸附動力學(xué)的基本參數(shù)和理論吸附量見表2。由表2數(shù)據(jù)可以得出準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的線性擬合相關(guān)系數(shù)較高(R2=0.999)并且由準(zhǔn)二級動力學(xué)方程得到的平衡吸附量(0.87 mg/g)與實測值(0.83 mg/g)更為接近。

圖6 MIPs的吸附動力學(xué)曲線Fig.6 Absorption kinetic curve of MIPs

圖7 Lagergren準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程對MIPs吸附天麻素的線性擬合Fig.7 Linear fitting of pesudo-first order sorption kinetcs and pesudo-second order sorption kinetics for gastrodin absorbed by MIPs

表2 MIPs吸附動力學(xué)擬合參數(shù)與Qe(實測值)Table 2 Absorption kinetics fitting parameters and Qevalues for MIPs

2.5 選擇性實驗

在評價MIPs的選擇性吸附性能時，選用與模板分子天麻素結(jié)構(gòu)類似的葡萄糖(圖1)作為競爭物，以判定MIPs對天麻素的選擇性。選擇性因子(β=Qe(天麻素)/Qe(葡萄糖))見表3所示。由表中數(shù)據(jù)得出MIPs對天麻素有較高的吸附量，這說明分子印跡聚合過程中形成了能夠識別模板分子天麻素的孔穴結(jié)構(gòu)和識別位點。

表3 MIPs對天麻素和葡萄糖的吸附量及選擇性因子β值Table 3 Qeof MIPs to gastrodin and glucose and selectivity factor β

3 結(jié)論

本研究以天麻素為模板，合成了對天麻素具有選擇性吸附效果的MIPs。與NIPs相比，MIPs表面粗糙多孔并且有更高的吸附容量和更多不同的結(jié)合位點。通過吸附動力學(xué)實驗可知，MIPs在30min即可吸附最大吸附量88.38%的天麻素，并且在100min左右達到平衡。在選擇性實驗中，MIPs對天麻素的吸附量遠(yuǎn)大于其結(jié)構(gòu)類似物，說明該MIPs具有良好的選擇性。本研究結(jié)果為今后開發(fā)對天麻素有特異性吸附功能的填料，以實現(xiàn)環(huán)保、高效、快速地分離天麻素，有一定的指導(dǎo)作用。

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