響應面優化酶法輔助提取邊麻菇多糖工藝

陳 帥，王兆豐

（1.靜寧縣甘溝鎮市場監督管理所，甘肅 靜寧 743400；2.靜寧縣食品藥品檢驗檢測中心，甘肅 靜寧 743400）

邊麻菇，又稱荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）、鹿茸菇、泥窩、荷葉蘑，屬于傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，是一種非常珍貴的藥食兩用食用真菌。因生長在甘肅海拔2 600 m以上，無任何污染的野生環境中，有著很強的抗病性能及豐富的營養成分，是一種富含人體必需氨基酸、礦物質、維生素和多糖等營養成分的高蛋白、低脂肪健康食品。多糖作為重要活性成分之一，因其獨特的功能特性而受到越來越多的關注，如抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、調節腸道微生物群[3]、抗糖尿病[4]、免疫調節[5]、乳化[6]和降脂[7]作用等。

制備活性多糖的第一步是優化提取工藝。據報道，提取工藝對多糖的產量、化學性質、生物活性和應用領域有重要影響[8]。傳統的熱水提取法（HEM）具有操作簡單、不需要特殊設備的優點，但其較高的提取溫度和較長的提取時間可能對多糖的生物功能產生不利影響[9]。超聲輔助提取法（UEM）可以通過超聲空化效應破壞細胞壁。而酶輔助提取法（EEM）通過酶解降解細胞壁，可以促進多糖產量的提高[10]。超聲波酶輔助提取法作為一種新的提取技術，結合了UEM法和EEM法的優點，已應用于多糖的提取。

EEM法的反應條件相對溫和，環保、高效、低能耗、易操作是EEM法的優勢。通常情況下，酶解溫度、酶解時間、酸堿度、酶用量、液固比等因素都會影響胞外多糖的提取率。響應面法是一種有效的數理統計方法，用于優化變量的影響和變量之間的相互作用對響應數據的影響，被廣泛應用于獲得提取多糖的最佳條件[11]。本研究采用響應面法中的Box-Behnken設計對提取條件進行優化，以期為邊麻菇多糖應用及開發提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

邊麻菇，購自肅南市場。在50 ℃下干燥后，將干燥的子實體粉碎成粉末用于多糖提取。

果膠酶（酶活≥30 U/mg）、纖維素酶（酶活≥30 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活≥400 U/mg）、復合酶由果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶按等比例（質量比1∶1∶1）組成。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶輔助法提取邊麻菇多糖

稱取一定量邊麻菇粉末按照一定比例加入去離子水，加入一定量復合酶，調節pH值，在溫度50 ℃酶解一定時間后，將提取物以5 982 r/min離心15 min，減壓濃縮上清液至原體積的1/4，加入無水乙醇沉淀濃縮后的上清液，使其終濃度為75%（體積分數），4 ℃靜置12 h；隨后以5 982 r/min離心15 min獲得沉淀，先后用乙醚、無水乙醇和丙酮洗滌沉淀。由氯仿和正丁醇以4∶1（V/V）的比例組成Sevag試劑，除去沉淀中的蛋白質，提取物通過分子量為1 400 Da透析袋進行透析，冷凍干燥后得到邊麻菇粗多糖，用公式（1）計算多糖得率：

1.2.2 液固比、酶解時間、復合酶質量分數、pH值對多糖提取的單因素影響試驗

試驗設計了4個多糖的提取變量（液固比、酶解時間、復合酶用量、pH值），比較其對多糖得率的影響。液固比（A，去離子水/子實體粉末，mL/g）設置15、20、25、30、35這5個處理；酶解時間（B）設置30、60、90、120、150 min這5個處理；復合酶質量分數（C，復合酶與子實體粉末混合物的質量比）設置5個處理，分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%；pH值（D）設置3、4、5、6、7這5個處理。第1試驗為液固比試驗，在15～35范圍內的單因素進行，其他3個參數，包括酶解時間、pH值和復合酶質量分數，分別設定為120 min、6和1.0%。此后，酶解時間、復合酶質量分數、pH值等3個單因素試驗均按照后一個單因素試驗根據前一個單因素試驗的最佳結果進行的原則。

1.2.3 響應面優化試驗（BBD）

在進行單因素設計試驗后，采用Design-expert軟件（8.0.6）進行四變量BBD試驗。每個變量包含3個梯度（－1，0，1），以多糖得率作為響應值，總共29次試運行，構成了整個設計表1。

根據BBD試驗的變量值和相應的邊麻菇多糖提取得率，得出4個提取變量和提取得率之間的關系，以二次多項式方程（2）表示如下：

其中，Y是多糖得率預測值，β0是常數，βi是線性系數，βii是二次系數，βij是交互項系數，Xi和Xj代表4個自變量。

依據回歸方程繪制等高線圖，將多糖得率以等高線圖的形式進行描述。每個等高線圖中，2個變量在測試范圍內，而其他變量固定在0水平。

對回歸模型驗證優化：根據回歸方程計算出的理論最佳數據（液固比、酶解時間、復合酶質量分數、pH值），進行3次重復驗證試驗，實際獲得的多糖平均得率與模型預測多糖得率進行對比，驗證回歸方程的準確性。

1.3 統計分析

采用SPSS 17.0對單因素方差分析進行比較。通過Duncan多范圍試驗進行平均值的多重比較，這些值顯示為平均標準偏差。用曲線估計法評價多糖水平對抗氧化作用的影響。P＜0.05被認為具有統計學意義。所有測定均測量3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 不同液固比對邊麻菇多糖提取效果的影響

液固比對邊麻菇多糖得率的影響如圖1A所示。邊麻菇多糖得率隨液固比變化呈先升高后下降的趨勢，當液固比為20時，邊麻菇多糖得率達到最大值（8.49%）；這種現象的可能原因是，當液固比相對較低時，邊麻菇粉末傾向于聚集在一起，水分子難以進入植物組織，導致多糖得率偏低[12]。隨著液固比的增加，提取液的黏度降低，水中溶解的多糖分子增加，導致多糖得率顯著增加，但當液固比高于20時，邊麻菇多糖下降；這一結果可能是因為當提取溶劑的量過大時，植物組織中的多糖的擴散距離增加，這可能抑制了多糖的溶解[13]；因此，最佳液固比選擇為20。

2.1.2 酶解時間對邊麻菇多糖提取效果的影響

酶解時間對邊麻菇多糖得率的影響如圖1B所示。隨著酶解時間從30 min增加到60 min，邊麻菇多糖得率顯著增加。酶解時間為60 min時，多糖得率最高，為9.89%。酶解時間為90 min時，多糖得率略有下降。隨著酶解時間進一步增加，到120、150 min時，多糖得率顯著下降，這意味著過長的酶解時間可能導致多糖降解[14]；因此，確定60 min的酶解時間作為響應面優化中心點。

2.1.3 復合酶質量分數對邊麻菇多糖提取效果的影響

圖1C顯示了復合酶質量分數對邊麻菇多糖提取效果的影響。隨著酶質量分數的增加，多糖得率呈現先顯著提高，隨后略有下降，當復合酶質量分數為1.5%時，多糖得率最大，為10.18%。這可能是因為隨著酶復合物劑量的增加，酶接觸底物的機會增加，這有利于多糖的溶解，導致多糖產量的提高[15]；然而，當酶的質量分數足以與底物反應時，進一步增加酶的用量不會提高多糖的產量；因此，選擇1.5%的酶復合物質量分數用于隨后的BBD試驗。

2.1.4 pH值對邊麻菇多糖提取效果的影響

pH值對邊麻菇多糖提取效果如圖1D所示，當pH值從3增加到5時，邊麻菇多糖的得率從9.15%顯著增加到10.48%，當pH值增加到6和7時，邊麻菇多糖得率顯著降低。原因可能是：酶的空間結構在不同的pH值下發生了變化，從而改變了酶的構象和活性[16-17]；因此，最適pH值為5。

圖1 液固比（A）、酶解時間（B）、復合酶質量分數（C）和pH值（D）對多糖提取效果的影響

2.2 邊麻菇多糖提取的BBD試驗結果分析

2.2.1 邊麻菇多糖提取得率的預測模型和方差分析

表1顯示了BBD試驗的變量值和相應的邊麻菇多糖提取得率。4個提取變量（A、B、C和D）和提取得率（Y）之間的關系以二次多項式方程（3）表示如下：

表1 邊麻菇多糖提取的Box-Behnken試驗設計及響應值

BBD試驗的方差分析結果如表2所示。失擬項P值（0.053 5）＞0.05，表明回歸模型具有良好的可靠性。模型的P值＜0.05，表明得到的回歸模型是顯著的。測定系數（R2）為0.872 6。此外，調整后的決定系數（adjR2）為0.745 3。高R2值和adjR2值表明4個變量之間的高度相關性，在BBD試驗中獲得了邊麻菇多糖優化條件。變異系數（C.V.，3.95%）較低，表明預測值與實際值一致。如表2所示，交叉積系數（BD）、線性系數（A、C）和所有二次系數（A2、B2、C2和D2）達到顯著水平；取變量的F值，其對多糖得率的影響順序為：復合酶質量分數＞液固比＞pH值＞酶解時間。

表2 Box-Behnken設計試驗的單向方差分析

2.2.2 預測模型的等高線圖

等高線圖是回歸方程的圖形顯示模式。如圖2所示，從等高線圖中看出，只有固液比和復合酶質量分數、酶解時間和復合酶質量分數這2個指標是圓形的，其他都為橢圓形的，說明二者之間相互作用較強。

圖2 邊麻菇多糖得率的等高線圖

2.2.3 回歸模型優化

根據預測回歸方程計算得到的多糖提取的提取參數如下：液固比20.94，酶解時間61.63 min，pH值5.11，復合酶質量分數1.65%，多糖理論得率為10.83%。為便于實際操作，提取參數設定為：液固比21，酶解時間62 min，pH值5，酶復合劑質量分數1.65%，3次重復驗證試驗多糖平均得率為（10.96±0.12）%，與模型預測多糖得率一致；因此，回歸模型可適用于邊麻菇多糖的酶法提取。

3 結論與討論

本研究采用酶輔助提取法制備邊麻菇多糖。通過響應面法設計，當液固比21，酶解時間62 min，pH值5，酶復合劑質量分數1.65%，3次重復試驗平均多糖得率為（10.96±0.12）%；因此，這種優化提取方法可以在生物活性物質提取研究中進一步推廣。

此法優于傳統熱水浸提法，主要由于在復合酶作用下，細胞壁被破壞，更多的糖溶于水提液中，但2種方法制備多糖抗氧化是否有差異，有待后續試驗進一步研究。