采用Pyrosequencing和Pooling技術對SNP位點多態性分析

趙珍敏，張素華

（司法部司法鑒定科學技術研究所 上海市法醫學重點實驗室，上海200063）

SNP位點作為第三代遺傳標記，由于其突變率低，在基因組中分布廣泛等特點，在法醫學中的應用越來越受到法醫學研究者的關注。SNP位點的多態性分析是判斷該位點是否納入法醫學應用的首要工作。進行多態性分析時，常采用 TaqMan、SNPstream或HRM等方法對大規模樣本進行檢測，對后續數據進行統計分析以判斷SNP位點的多態性。這樣的方法普遍成本高，耗時多，工作量大。本研究中擬采用pooling技術建立一組池，采用pyrosequencing這一短片段高精度的測序技術，對SNP位點進行等位基因定量分析，從而快速得到其多態性信息。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

50份健康志愿者的靜脈血樣本，保存于抗凝管中。其中男性25名，女性25名。

1.2 試劑與儀器

QIAamp DNA Mini and Blood Mini試劑盒、PyroMark PCR試劑盒、PyroMark Gold Q96試劑盒、結合緩沖液、復性緩沖液、變性緩沖液與洗滌液（德國Qiagen公司）。鏈霉親和素包被的磁珠（國藥集團化學試劑有限公司）。引物及生物素標記（基康生物公司）。

7500型實時熒光定量PCR儀（美國life公司）；微孔板光度計（美國Biotek公司）；單鏈DNA制備純化裝置和焦磷酸測序儀（德國Qiagen公司）。

1．3 位點選擇

納入研究的位點分別為：rs220028、rs2074399和rs760087。

1．4 組池構建

本實驗中所構建的組池由上述50名無關個體的DNA樣本組成。采用Investigator Quantiplex定量試劑盒在7500型實時熒光定量PCR儀上進行DNA濃度的精確定量，每個樣本重復3次。R2值≥0．990為有效數據，樣本DNA測定濃度必須滿足3次測定結果偏差＜5%且樣本濃度不低于40 ng/μL。采用Buffer AE（10 mM Tris·Cl，0．5 mM EDTA，pH 9．0）將每個樣本濃度稀釋至40 ng/uL，采用微孔板光度計再次進行DNA定量，每個樣本重復3次。要求3次測定結果偏差＜5%。將稀釋后的樣本各取1．5 μL，進行等量混合，構建實驗用組池。

1．5 引物設計

采用PyroMark Assay Design 2．0軟件中的AQ模式進行SNP位點的引物設計。

1．6 PCR擴增與質量檢測

采用PyroMark PCR試劑盒對組池樣本進行上述3個SNP位點的PCR擴增。具體PCR體系構建及擴增條件參見試劑盒操作說明書。對擴增后的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR產物的質量。

1．7 SNP位點的測序檢測

取 PCR擴增產物20 μL，加入40μL結合緩沖液、1．5 μL 鏈霉親和素包被的磁珠和 18．5 μL 純水，1，400 rpm混勻10 min后，置于70%乙醇、變性緩沖液10s，洗滌液洗滌15s，純化得到標記生物素的單鏈DNA。將單鏈DNA模板轉入含測序引物（10 μM）的復性緩沖液中，80℃雜交3 min，冷卻至室溫。將酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）、底物混合物（底物APS和熒光素）和4種dNTP按PyroMark Q96軟件中規定的數目加入相應試劑艙中，按所建立的測序方法進行測序檢測。每個位點的檢測重復3次。

1．8 統計分析

對測序結果進行分析，3次所得結果的平均值為該SNP位點的等位基因定量分析結果；依據該結果進行法醫學參數的計算；采用Arlequin對本次研究所得頻率信息與以往研究中所得頻率信息進行差異性分析。

2 結果與討論

在制備pooling樣本池時，最關鍵的步驟是DNA的等量混勻，混勻的前提在于DNA的精確定量[1-2]。本實驗中主要采用的是Investigator Quantiplex定量試劑盒在7500型實時熒光定量PCR儀上進行DNA定量。該試劑盒主要用來確定樣本是否含有足量DNA以接受DNA指紋圖譜分析等，并確定樣本是否含有可能干擾PCR進行的抑制劑。抑制劑的檢測主要是將DNA標準內參CT值和未知樣本內參CT值進行比較，其中內參陽性擴增產生的CT值約為31。與標準曲線樣本相比，可能出現內參CT值有±1范圍的波動。對于DNA濃度＜40ng/uL或者含有PCR抑制劑的樣本進行DNA重新提取，滿足要求后將其進一步稀釋至40 ng/uL，再次定量，從而保證定量的準確性及后續PCR反應的順利進行。

采用 PyroMark Assay Design 2．0軟件進行 SNP位點引物設計的信息見表1。pyrosequencing技術在進行DNA序列分析時不需要電泳和熒光標記，可以直接測定引物后面的堿基序列，定量性能好，結果準確，可實現自動化，是一種實時DNA測序技術。檢測時產生的熒光信號強度與聚合的dNTP個數成正比，根據加入的dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核苷酸序列。對50份DNA樣本所構成的組池樣本采用pyrosequencing技術在3個SNP位點進行等位基因定量分析，統計分析結果見表2。通過Arlequin軟件統計分析發現，與文獻[3]中所報道的rs220028位點頻率數據信息無顯著性差異（p＞0．05）。

表1 SNP位點進行等位基因定量分析的引物信息

表2 SNP位點的等位基因頻率分布及法醫學參數

本次研究中所選擇的3個SNP位點等位基因頻率分布好，多態性好，可滿足法醫遺傳學遺傳標記應用要求。其次，Pyrosequencing技術結合pooling方法用于等位基因定量檢測的技術準確可靠，方便快捷，可以快速得到SNP位點的多態性信息，適用于位點的初篩及大規模頻調。

參考文獻：

[1]陳逸飛，鐘詩龍，羅建方，等．基于DNA pooling技術的全基因組關聯研究篩選主動脈夾層等位基因遺傳位點[J]．實用醫學雜志，2012，28（20）：3405-3407．

[2]Men T， Zhang X， Yang J， et al．The rs1050450 C＞T polymorphism of GPX1 is associated with the risk of bladder but not prostate cancer： evidence from a meta-analysis[J]．Tumour Biol．2013．

[3]Zhao G， Yang Q，Huang D， et al．Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J]．Forensic Sci Int， 2005，154（2-3）：122-7．