豬瘟病毒分子生物學及豬瘟防控概述

廖生錢 福建省南靖縣山城鎮畜牧獸醫站 363600

豬瘟病毒分子生物學及豬瘟防控概述

廖生錢 福建省南靖縣山城鎮畜牧獸醫站 363600

豬瘟又稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種傳染病。它具有高度傳染性和致死性，我國1984年就將豬瘟列為一類動物疫病[1]。到21世紀的今天，豬瘟仍是造成世界上大多數的養豬大國重要經濟損失的疾病之一。

早在1903年，就有學者確定了豬瘟病毒的病原體是一種濾過性病毒。豬瘟的高免血清最早被成功研制是在1908年的匈牙利，這也從側面表明豬瘟當時已在歐洲相當流行。日本1909年報道發生了豬瘟，并開始研究該病。1925年，中國東南大學農科系也開始研制免疫血清用于防治豬瘟[2]。

1 病 原

1.1 形態與結構 到目前為止，仍只發現豬瘟病毒只有一個血清型，但毒力的強弱卻是有分別的。豬瘟病毒粒子直徑34～50 nm，略呈圓形，具有脂蛋白囊膜。在電鏡下觀察，可以發現病毒粒子表面有脆弱的纖突結構。豬瘟病毒的等電點是4.8，在蔗糖密度梯度中的浮密度是每立方厘米1.15～1.16 g。

1.2 病原的基因結構和功能 豬瘟病毒的基因組長大約12.3 kb，由中間一個大的開放閱讀框（ORF）和兩端非編碼區 5'-UTR（untranslated re-gion）及3'-UTR構成。ORF編碼一個多聚蛋白，該多聚蛋白由3 898個氨基酸殘基組成，并在翻譯后或翻譯過程中，被病毒自身編碼的蛋白酶和宿主細胞的蛋白水解酶加工切割成 12種蛋白質：Npro（p23）、C（p14）、Ems（gp44/48或 E0）、E1（gp33）、E2（gp55）、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。在非編碼區結構中，3'-UTR長222～243 bp，具有較高的屬內保守性。5'端為一可變區域，3'端為無poly-A的尾巴，研究表明豬瘟病毒復制的起始位點就是位于3'端中的一段十分保守的富含ATTT的核苷酸序列中[3]。在該編碼區通過與復制相關的RdRp酶和NS5B及相應輔助因子的作用下，以病毒RNA為模板，從3'-UTR起始部位處合成負鏈RNA，形成雙鏈RNA中間體，緊接著以負鏈RNA為模板在相應病毒RNA的5'-UTR位置起始處以幾何遞增的方式合成病毒基因組RNA。5'-UTR可以構成比較復雜的二級結構，它的5'端缺乏甲基鳥苷帽子結構，長360～374 bp，是毒株間最保守的部分。在豬瘟病毒復制過程中，5'-UTR作為基因翻譯的重要調控位點。另據報道，5'-UTR的5'-末端保守片段GTATACGAGGTTA還可能影響病毒的復制，在病毒增殖過程中起著重要的作用[3]。

1.3 蛋白質組成 豬瘟病毒的ORF編碼含有3 898個氨基酸殘基的多聚前體蛋白，這個多聚前體蛋白在宿主細胞蛋白酶的作用或病毒的作用下能夠裂解為12種病毒成熟蛋白，其中8種為非結構蛋白，4種為結構蛋白。八個非結構蛋白分別為Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，4個結構蛋白為衣殼蛋白c和3種囊膜糖蛋白。 對3種囊膜糖蛋白的命名存在一定的爭議，但主要有以下兩種命名辦法：一是命名為E0、E1、E2；二是命名為E2、E3、El。有研究人員認為前一種命名方式既能夠與同一病毒科不同屬的類丙型肝炎病毒屬丙型肝炎病毒E1和E2蛋白相對應，又能體現出它們在基因組的順序。許多文獻表明，E0、E1、E2這三種病毒粒子是通過二硫鍵的作用以二聚體結構的形式存在于病毒粒子和感染的細胞中。研究發現，不同的糖蛋白結構在病毒復制中的作用也不同。

1.4 復制 豬瘟病毒在進入宿主體內后，通過以下兩種方式進入宿主細胞內：一種通過囊膜糖蛋白E0和E2的作用下細胞膜融合；二是受體介導的內吞作用進入宿主細胞。豬瘟病毒在實驗室中體外培養感染豬瘟病毒的細胞時，豬瘟病毒一般不引起培養細胞的病理變化。但在培養豬瘟病毒感染的豬腎細胞進行傳代時，卻能夠導致囊膜糖蛋白E0的C端的Ser476突變為Arg殘基。在豬瘟病毒進入宿主細胞后，豬瘟病毒的RNA是怎么樣從核衣殼中釋放的目前還不太明確。

豬瘟病毒為有囊膜的ssRNA病毒，其基因組是單股正鏈的。豬瘟病毒的復制和普通正鏈RNA病毒是一樣的，就是豬瘟病毒在進入宿主細胞后，首先釋放核酸作為RNA，然后合成酶和蛋白，最后在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下，從基因組的3'到 5'方向復制合成負鏈RNA，與正鏈RNA形成復制中間體，然后復制中間體產生大量子代正鏈RNA，參與后續的蛋白質合成和病毒粒子裝配過程。

調控豬瘟病毒基因組復制最關鍵的序列在于5'-UTR和3'-UTR，豬瘟病毒的復制主要包括以下兩步：首先以正鏈RNA為模板合成負鏈RNA，然后以新合成的負鏈RNA為模板合成正鏈RNA。3'-UTR是豬瘟病毒基因組的第一調控位點，5'-UTR是豬瘟病毒以新合成的負鏈RNA為模板合成正鏈RNA時的重要調控位點，此外，5'-UTR還是豬瘟病毒基因翻譯的主要調控位點。5'-UTR和3'-UTR中各存在一段17個堿基的區域，除了四個堿基錯配外，其余彼此完全互補配對，這兩個區域可能參與基因組的環化。依賴RNA的RNA聚合酶與正鏈RNA的3'-UTR的結合位點結合后，不需要引物的作用，以正鏈RNA為模板合成負鏈RNA。在依賴RNA的RNA聚合酶接觸到位于5'-UTR內的復制起始識別單位的同時，就為合成第2條鏈做構象上的準備。依賴RNA的RNA聚合酶在到達5'終端時，由于發夾結構的作用，繼續延長正在合成的RNA鏈。然后以負鏈RNA為模板通過copy-back的機制合成正鏈RNA，連接處的單鏈部分后來被水解。在BVDV的NS5B蛋白試驗中證明了核苷酸轉移酶活性，同時，試驗中復制產物的雙價RNA遠遠多于模板的雙價RNA，也為證明copy-back機制的存在提供依據[4]。

1.5 致病機理 豬瘟病毒可以感染豬的許多器官，如腦、腎、舌、扁桃體、淋巴結等器官和腺體均能夠檢測到豬瘟病毒。

豬瘟病毒感染豬只后能夠引起豬只產生免疫抑制，能夠引起白細胞的減少特別是淋巴細胞的減少。這是由于豬瘟病毒對豬淋巴組織、血液、回腸等組織具有親嗜性，在易感豬只感染豬瘟病毒時，豬瘟病毒首先進入豬的扁桃體、扁桃體外周淋巴結的上皮細胞和B濾泡，并在其內復制。急性豬瘟一般導致死亡的原因之一就是豬只感染豬瘟病毒后自身的免疫系統被破壞。

人工給豬只接種豬瘟強毒后發現，豬瘟病毒能夠引起αβ-TCR+T細胞、γδ-TCR+T細胞的缺失。此外，豬瘟病毒能夠導致宿主T淋巴細胞的增殖能力明顯降低和B細胞的急劇減少。有研究表明，宿主感染豬瘟病毒后自身淋巴細胞的減少激活了細胞程序性死亡[5]。

2 豬瘟的診斷與防控

目前，豬瘟的診斷主要有臨床綜合診斷和實驗室診斷。臨床診斷主要通過豬瘟的臨床癥狀、解剖后的病理變化以及流行病學調查等幾方面進行綜合考慮后進行斷定。由于豬病越來越復雜，豬病的發生往往不是單一的而是多種疾病并發。所以，臨床診斷存在一定的困難，要確診一般依靠實驗室診斷。

2.1 實驗室診斷 目前，我國進行豬瘟的實驗室確診方法主要有以下幾種。

2.1 .1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ELISA發展到今天，產生了許多種方法，如間接法、雙抗體夾心法。需要指出的是，我國普遍用兔化弱毒苗進行強制免疫，豬血清中幾乎都有豬瘟抗體，這給豬瘟抗體的檢測帶來一定的困難。

2.1 .2 免疫熒光（IFA） IFA有直接和間接兩種。用免疫熒光實驗診斷豬瘟最大的優點就是能夠檢測到帶有豬瘟強毒的隱性豬，這對豬場進行豬瘟的凈化具有重要的意義。

2.1 .3 瓊脂擴散試驗 （AGPT） 瓊脂擴散試驗有單向和雙向兩類，它的特點是操作簡單，易于判定可測抗原或抗體。但敏感度低。

2.1 .4 兔體交互免疫試驗 兔體交互免疫試驗專門用于檢測豬瘟病毒，它能準確可靠檢測出送檢病料中是否存在豬瘟病毒或者兔化弱毒，而且該實驗方法對技術、實驗設備等都要求不高。

2.1 .5 病毒學診斷 主要檢測在組織中或組織細胞培養中的病毒。將病毒分離培養后，進行免疫酶染或免疫熒光染色，鏡檢。

2.2 防治 目前尚無針對豬瘟的特效藥物，主要采取以預防為主、治療為輔的綜合性防治措施。根據我國有關法律法規，發生豬瘟并確診后應對疫點進行全部撲殺和無害化處理。但結合我國國情和養豬業特點，顯然不可能達到消滅和控制豬瘟病毒的目的。在我國現階段，主要采取加強科學的飼養管理、因地制宜結合自身情況制定個性化的免疫程序、建立免疫監測淘汰感染豬逐步凈化豬群、盡量做到自繁自養實行“全進全出”的飼養模式、截斷傳染源、定期合理消毒及無害化處理等相結合的綜合防控措施。

3 存在問題

3.1 現場診斷困難 近年來，由于豬病越來越復雜和許多類似豬瘟臨床癥狀的出現，加上豬瘟病毒毒力發生變化使得豬瘟越來越不好被診斷。要確診是否被豬瘟病毒感染越來越依賴于實驗室診斷，但實驗室診斷需要具備一定的條件和設備，具有一定的局限性，目前也還未有現場就可以操作進行確診豬瘟的辦法。

3.2 豬瘟疫苗本身無法消滅豬瘟 不可否認，現在廣泛使用的三大品系豬瘟弱毒疫苗（中國的C2株、法國的Thiverval株和日本的CPE2株）對控制豬瘟發揮了巨大的作用[6]。疫苗的使用，只是對機體產生防護層，只能降低豬瘟病毒的循環力度和傳播范圍，豬瘟疫苗本身是無法消滅豬瘟病毒的。而且致弱疫苗本身也存在基因突變或與野毒發生重組而造成毒力逆強的機率，同時豬瘟野毒仍然存在并以低水平在傳播。

亞單位疫苗應用的先決條件是需要一個高效的表達系統。因為只有足夠量抗原存在時才能誘導出保護性的免疫應答反應。但是現在能夠高表達的亞單位疫苗很少[7]。

3.3 傳統的飼養方式不利消滅豬瘟 我國養豬業的特點是規模化低、散養戶多。散養戶的豬只感染豬瘟后，往往沒有進行科學的處理，導致成為持續的傳染源。而且這些散養戶在飼養的同時往往也配合泔水飼喂，而泔水往往攜帶豬瘟病毒。

3.4 免疫監測和早期預警困難 免疫后不管不問是消滅豬瘟病毒的主要障礙之一，我國還未有科學的免疫監測方法，使得疫苗注射和免疫監測嚴重脫鉤。目前，也尚未發現對豬瘟進行早期預警行之有效的方法，我國也未有相關機構或個人對豬瘟早期預警工作進行深入系統的研究。

[1]國際獸疫局.哺乳動物,禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊 [M].3版.農業部畜牧獸醫局,譯.1996: 128-135.

[2]呂宗吉,涂長春,余興龍.豬瘟流行特征的新變化[J].黑龍江畜牧獸醫,2001（8）:39.

[3]袁東波,湯德元,曾智勇,等.豬瘟病毒的分子結構及其新型疫苗研究[J].世界農業,2007,345（1）:59-60.

[4]Flores E F,Kreutz L C,Donis R O.Swine and ruminant pestiviruses require the same cellular factor to enter bovine cell2s[J].J Gen Virol,1996,77（Pt6）:1295-1303.

[5]Zhong W,Gutshall L L,Del Vecchio A M.Identification and characterization of an RNA dependent RNA polymerase activity within the nonstructural protein 5B region of bovine viral diarrhea virus[J].J Virol,1998,72:9365-9369.

[6]李學伍,張改平,郭啟祥,等.豬瘟病毒生物學特性研究概述[J].河南農業科學,2007(10):14.

[7]王鎮,丁明孝.豬瘟病毒致病機制及防治的研究進展[J].畜牧獸醫學報，1998,29（5）:449-454.

A

1003-4331（2014）03-0027-03