PD-L1抑制同種淋巴細胞增殖反應研究

文 雪

（湖北職業(yè)技術學院護理學院基礎醫(yī)學教研室，湖北 孝感432000）

目前已證實I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關，自身反應性T細胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機理中起主導作用[1]。移植胰島細胞治療I型糖尿病是一個具有前景的治療策略，然而自身反應性T細胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。程序性死亡分子配體-1（PD-L1）和程序性死亡分子配體-2（PD-L2）已被證實為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達提示PD-L1可以調節(jié)自身反應性T細胞或B細胞，同時（或者）調節(jié)靶器官的炎癥反應。有研究表明，PD-L1信號可以介導T細胞的凋亡，在腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過抗體阻斷PD-1：PD-L1這條通路可促進NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實驗在前期構建PD-L1表達載體和初步研究其功能的基礎上，進一步研究PD-L1對同種淋巴細胞的負性調節(jié)作用，通過建立穩(wěn)定表達PD-L1胰島細胞株，觀察PD-L1對同種淋巴細胞增殖的影響，為PD-L1修飾胰島細胞移植重建糖尿病患者胰島細胞功能研究提供新的策略。

1 材料

NIT-1細胞株（小鼠胰島β細胞株）由澳大利亞WEH1實驗室惠贈，本室傳代培養(yǎng)與保種。pEGFP-N1-PD-L1質粒含有表達綠色熒光蛋白（EGFP）基因序列，由本科室構建。陽離子脂質體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，抗體、CFSE購于美國BD公司。

2 實驗方法

2.1 轉染PD-L1基因的NIT-1細胞穩(wěn)定子篩選

根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑說明書進行。將NIT-1細胞轉種于24孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞達到50～80%的融合；用無血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質體，將脂質體與核苷酸混合，室溫下靜置30min后，在24孔板中加入以上混合液，輕混；培養(yǎng)6h后棄轉染液，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀檢測GRP78的表達。

2.2 CFSE染色檢測PD-L1修飾NIT細胞對同種淋巴細胞增殖影響

將Balb/c小鼠頸椎脫位處死，無菌取脾臟制備成脾淋巴細胞懸液，加入CFSE（2μmol/L）染色 ，調整細胞濃度作為同種反應淋巴細胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調節(jié)細胞濃度，加入無菌絲裂霉素C（終濃度為30μg/ml），調節(jié)細胞濃度作為刺激細胞備用。將Balb/c小鼠脾細胞懸液（反應細胞）分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個細胞；將刺激細胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個細胞；實驗分組：① NIT-PD-L1+淋巴細胞；②NIT-EGFP+淋巴細胞；③NIT+淋巴細胞。反應細胞和刺激細胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測定淋巴細胞增殖。

2.3 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行方差分析和t檢驗。

3 實驗結果

3.1 穩(wěn)轉NIT-1細胞中EGPF或PD-L1的表達

pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達載體分別轉染NIT-1細胞，培養(yǎng)48h后，經(jīng)FCM檢測EGPF和PD-L1的表達。結果顯示：對照組（NIT）EGPF表達率為0，pEGFP-N1轉染NIT細胞組EGPF表達率為 87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1 轉 染 NIT 細 胞組 EGPF 表 達率 為88%±6.8； 對照組 （NIT）PD-L1 表達率為 5.4%±0.8，pEGFP-N1 轉染NIT 細胞組 PD-L1 表達率為 4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1 轉染 NIT細胞組 PD-L1 表達率為 90%±5.3（P＜0.01）。

3.2 PD-L1可顯著抑制同種淋巴細胞增殖

CFSE染色流式細胞儀檢測結果顯示：NIT-PD-L1+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（4.5±1.6）；NIT-EGFP+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（9.1±2.1）；NIT+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（8.5±3.1）。 結果說明 PD-L1 可以抑制同種淋巴細胞增殖，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

4 討論

PD-L1是正性或負性調節(jié)T細胞受體（TCR）介導的信號通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠，體內(nèi)應用拮抗的單克隆抗體（mAb）阻斷B7-H1可以活化效應T細胞，結果促進了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，在半抗原誘導的小鼠接觸性過敏反應模型或實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同樣促進了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結果說明，PD-L1在同種免疫應答中的重要負性調節(jié)功能。本實驗以PD-L1真核表達載體轉染NIT-1細胞作為體外細胞模型，研究PD-L1的負性調節(jié)功能。從細胞混合培養(yǎng)結果可以看出，PD-L1抑制淋巴細胞的增殖，提示PD-L1抑制反應性淋巴細胞的活化。本實驗證明PD-L1對同種免疫應答具有負性調節(jié)功能，并初步探討了其機制，對于誘導并維持免疫耐受具有一定作用。

［1］Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell L,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992：339,458.

［2］Freeman GJ,Long AJ,Iwai Y,et al.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J].J.Exp.Med.,2000：192,1027.

［3］Ansari MJ,Salama AD,Chitnis T,Smith RN,Yagita H,Akiba H,Yamazaki T,Azuma M,Iwai H,Khoury SJ,Auchincloss H Jr,Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1)Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic(NOD)Mice[J].J Exp Med.,2003：63,69.

［4］Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2004,4：336-47.

［5］Dong H,Strome SE,Salomao DR et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med.,2002,8：793-800.

［6］Latchman YE,Liang SC,Wu Y et al.PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells,antigen-presenting cells,and host tissues negatively regulates T cells[J].Proc Natl Acad Sci.USA,2004,101：10691-6.