雞新城疫血凝抑制試驗的質量控制

趙平偉 ，費 強

（1.山西省飼料獸藥監察所，山西太原030027；2.山西省汾陽市動物疫病預防控制中心，山西汾陽 032200）

雞新城疫血凝抑制試驗（HI試驗）是診斷新城疫疫病、掌握雞群動態、制定免疫程序的重要手段，因為其快捷、成本較低、便于操作、能夠處理大量的樣品，所以成為動物疫病實驗室常用的檢測方法。但是很多從業人員缺乏系統的血清學檢測知識，容易出現試驗結果偏差，甚至誤判，造成新城疫的發生和流行，給雞場帶來巨大的經濟損失。

因此，正確運用和熟練掌握試驗方法至關重要。筆者在長期實驗室工作中反復操作，不斷摸索，積累了一些經驗，原與大家共同探討。

1 新城疫血凝試驗和血凝抑制試驗的原理和方法

新城疫病毒能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發生凝集，此即為新城疫血凝試驗（HA試驗）。方法是用雞紅細胞與新城疫標準抗原作用，檢測出標準抗原血凝單位，為血凝抑制試驗作準備。而紅細胞凝集現象可于新城疫病毒懸液中加入特異性免疫血清所抑制，即為血凝抑制試驗。方法是將檢測出血凝單位的新城疫標準抗原配制后與受檢血清反應，再加入紅細胞作用。血凝抑制試驗用于檢測受檢血清抗體血凝抑制滴度，判定受檢血清抗體是否為陽性。

2 器材的選擇

2.1 反應板、移液器、吸頭的選擇

為使微量反應板、移液器、吸頭保持最佳工作狀態，應建立選擇、使用、維護的標準操作程序，條件允許的情況下，微量反應板、吸頭盡量使用一次性產品。

反應板最好用96孔V型板，切記不可用試管刷刷板，以免破壞孔內壁的光滑性。板必須刷凈，不干凈的板會出現自凝現象。試驗完畢后，用自來水反復沖洗反應板，浸在2％鹽酸溶液中1小時，再用自來水沖洗，浸入1％氫氧化鈉 15分鐘后，拿出來用自來水沖洗，最后浸泡于蒸餾水中30分鐘以上，撈出后將孔內水甩干凈，倒放于37℃恒溫箱中烘干備用。對底部磨損嚴重的反應板要及時淘汰。

實驗時應選用數字式單道和多道移液器。平時要做好移液器的保養及校驗工作，這對保證移液器的準確性非常重要，每次使用完畢，要將移液器量程調至最大刻度，以保持移液器彈簧的最好靈敏度，使用前核對刻度容量與實際容量是否相符。

吸頭應光潔平滑，能與移液器上的吸頭套密封完好。

2.2 樣品的采集與保存

從1日齡測定新城疫母源抗體開始，定期采樣監測，早期每隔1～2周監測一次，以后隨日齡的增大每3～4周測定一次。樣品應具有足夠的數量和一定的代表性，一般萬只以上雞群按0.5％采樣，小型雞群按1％采樣。采樣時應從雞群的多個位置抓雞，采集病、弱雞只血樣應單獨標明。

隨機采樣時，應對雞群品種、日齡、疫苗種類、疫苗廠家、生產批號、免疫時間、免疫途徑、采樣數量等詳細登記，以便檢測后進行結果分析和判斷，為新城疫免疫提供數據。

在翅靜脈采血時，多用一次性塑料管引流采血，其優點是簡單、快速，對雞只損傷小，封口后便于攜帶、存放和分離血清。采樣時采血量不得少于管長的2/3，否則血量過少，分離到的血清不足，影響監測結果。采血后，塑料管的一端要隨即密封，以免漏掉血清。如果用注射器采血，可用清潔、干燥無菌的小瓶盛裝，血液要放成傾斜，不能直立，否則不易分離出血清。另外還要在塑料或小瓶上標明編號，以便區分。

除了離心分離血清外，如果想讓血清自然析出，不要馬上將血清放于冰箱內，要在室溫（20℃左右）下放置2～3小時，待血清析出后，再放入4℃冰箱內，這樣不但有利于血清的析出，又可避免血清高溫下污染變質和溶血現象發生。

2.3 試劑的配制

雞新城疫血凝抑制試驗最常用的稀釋液為0.85％的生理鹽水，要求其無菌、無雜質。稀釋液PH值調整為7.0時，紅細胞沉降最充分，圖像最清晰，HI滴度值最大。若稀釋液偏酸性，易使紅細胞溶解；偏堿性時，吸附于紅細胞上的病毒易脫落。

不同雞的紅細胞對新城疫病毒的敏感性不同，有的雞紅細胞有自凝現象，有的雞紅細胞沉降慢，故試驗時最好采3～4只成年健康公雞的血液混合，并用生理鹽水多次充分洗滌。紅細胞懸液的濃度要盡量準確，如果濃度偏低，HA效價就偏高，HI效價就偏低；相反地，如果紅細胞懸液濃度偏高，HA效價就偏低，HI效價就偏高。紅細胞懸液使用時最好現用現配。

由于新城疫HI試驗的結果判定是以完全抑制4單位抗原（4HAU）的血清最高稀釋倍數作為HI滴度的，檢測用的抗原稀釋為4單位抗原后還需要一次回歸實驗，即檢測4單位抗原是否準確。抗原回歸步驟如下：取50微升的生理鹽水加入微量反應板的第1～4孔；將配制的4單位抗原50微升加入第1孔，然后依次倍比稀釋至第4孔，最后棄去50微升；4個孔再補加50微升生理鹽水，最后4個孔加紅細胞懸液50微升并混勻，室溫靜置30分鐘觀察結果。若第1、2孔紅細胞完全凝集，第3孔出現75％凝集，說明4單位抗原配制準確，可用于HI試驗。若第3孔也出現完全凝集，說明HA效價提高了一個滴度，需等量稀釋抗原；若只有第1孔出現完全凝集，說明HA效價降低了一個滴度，抗原量需要加倍。如果標準抗原血凝價偏高，測定的血清抗體效價將偏低，反之待測定的血清抗體效價偏高。所以標準抗原的配制及檢測的準確性對實驗結果產生較大影響。

3 操作中的注意事項

微量移液器使用時有二個阻力位置，壓到第一個阻力位置為所調刻度的量值，為吸取液體時使用，再加壓力的第二個阻力位置為放液時使用。注意拇指用力，不要在吸取液體時將移液器重力壓過第一個阻力位置，否則會造成吸取液體偏多使試驗結果不準確。

在新城疫HI試驗中有4次加樣步驟，即加生理鹽水、待檢血清、4單位抗原、紅細胞懸液。加樣時應注意以下幾點：移液器吸頭需碰觸器壁以除去多余的液體；吸頭內液面應保持一致；在對被檢血清進行倍比稀釋時，吸頭要插入液面以下，避免產生泡沫；加4單位抗原和紅細胞懸液時，吸頭要離開液面，最好從后往前加；紅細胞懸液在試驗時要充分搖勻等。

環境溫度對新城疫HI試驗值的影響比較大，呈正相關。同時環境溫度影響出現結果的快慢，溫度高，出現結果快；但溫度過高，會出現反應物解離和紅細胞溶血現象，所以，實驗室應配備空調，將溫度控制在20℃～25℃。

在室溫下，抗原抗體作用25～30分鐘為宜，加入紅細胞懸液后，以紅細胞對照完全沉淀的前后5分鐘內判定結果較好。判定結果偏早，所測得的結果不能反映實際抗體水平；判定時間太遲，紅細胞易發生溶血現象，導致試驗無效。

4 結果判定

在對照孔出現正確結果的情況下，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度。

監測雞群的免疫水平時，要求新城疫血凝抑制滴度大于或等于4 log2，但是抽檢樣品若有10％以上出現11 log2以上的高血凝抑制滴度，應考慮雞群是否受到新城疫強毒感染。

5 試驗中常見錯誤分析

全部凝集：紅細胞受到污染或保存時間過長；4單位抗原效價過高或滴加失誤；生理鹽水受到污染。

整板無凝集：4單位抗原失效；試驗中少加4單位抗原步驟；環境溫度高，讀秒時間拖延。

跳孔：倍比稀釋時，操作順序錯亂；使用多道移液器時，每次吸取的液體量不一致；個別孔滴加4單位抗原時遺漏。

整板樣品效價為1 log2：操作時遺漏了倍比稀釋步驟。