人類單核苷酸多態性研究進展

蘇 津 綜述，包娜娜，李會來，陳占國 審校（河北省秦皇島市撫寧縣中醫院 066300）

根據“人類基因組計劃”，人類對自身基因組中的核苷酸序列進行了深入的了解與認識，這個計劃的關鍵目標在于尋找功能基因，并且說明特定基因組區域里序列產生的差異［1］。單核苷酸多態性（SNP）在基因組中的序列差異最為普遍，在多個學科的領域中具有重要的意義，發揮著巨大的作用。SNP指在基因組水平中由單核的苷酸變異引發DNA的序列產生多態的變化，在人類遺傳變異中最為常見，也是人類基因組計劃后才進行研究的最新遺傳標記。作者針對SNP的概念與特性，闡述其研究的價值與意義，并對研究方法進行綜述，旨在探討SNP在遺傳學、生物醫學以及人類進化史中發揮的作用。

1 SNP的概述

SNP作為基因組DNA中單堿基的序列差異，在人群中的分布率占1%以上，但是基因組里其他序列差異導致的變異不屬于SNP范圍，比如重復、缺失以及插入序列復制數目發生變化［2］。另外，SNP所引起的人類遺傳基因多態性在遺傳信息中的本質表現占90%以上。

從生物遺傳的角度來說，SNP特點包括：（1）將兩個隨機染色體加以對比，每一千個堿基里面就會有一個SNP。（2）在基因內部中有部分SNP將對蛋白結構，或是表達水平造成直接影響，以利于充分了解疾病的遺傳機制。（3）在進化史中，SNP僅發生過一次變異，因此其遺傳特性更加穩定。（4）高通量SNP篩選隨著SNP研究成本降低以及研究方法的發展，將對遺傳學分析起到促進與推動的支持作用［3］。

2 SNP的研究價值

2.1 疾病病因在大多數人的概念中，每一種疾病均可發現遺傳因素的影子［4］。SNP在基因組中的變異能夠起到兩個作用，一個是作為遺傳學的一種分子標記物，另一個至關重要的作用就是能表達出基因和疾病之間的關系，對疾病中存在的有關基因進行搜索。對于部分單基因的遺傳性疾病，采用家系研究方法對疾病的病因進行搜索的應用，在目前臨床上已經取得了一定的成果。但是，在多基因疾病中，因為基因數目和影響疾病發生發展存在的差異，且環境因素也起到了重要作用，在病因學研究方面多基因疾病增加了很多的困難。SNP研究的重點為通過SNP圖譜的構建，為尋求和疾病有關的基因，開展全基因方面的研究，在現階段研究里面主要采取的研究方法就是直接法、間接法。直接法通過尋找cSNPs及基因編碼，獲取對疾病易感性產生影響的基因序列變異，并且根據對現在研究的分析，在人類基因序列編碼區域中cSNPs的數量只有2、3個變異，其頻率在10%以上，而編碼區域內并不包括全部的功能性變異，因此不能被廣泛應用。間接法所尋找的目標就是和致病性相關的中性多態位點，而且對于氨基酸編碼和蛋白的結構不會被改變，且不會使表現型改變。但是，在染色體方面有些疾病有關的基因突變位點將可能發生連鎖效應，甚至還會遺傳至后代［5］。

2.2 藥物基因組學人類基因組框架序列于2001年建立完成，與此同時，誕生了以個體遺傳學為主，運用醫源性藥物原理，對患者臨床的藥效和不良反應加以評估的一門藥物基因組學［6］。此學科利用基因組學的研究技術，比如生物學信息、化學信息、基因圖譜、高通量DNA的檢測序列，使得研究人員可以針對個體和群體間產生的藥效差異予以準確遺傳學基礎的定性，主要在于對特定患者進行診療，防止藥物造成不良反應及對藥物靶點加以設計。通過個體化醫療手段對患者用藥起到正面作用，并按照個體基因型的特異性對患者進行藥物的優化配置，使得藥物的臨床療效更為顯著，不良反應更小。在藥物基因組研究中，由于SNP位點的差異，將會對基因的表達、蛋白質結構、氨基酸的剪切以及編碼產生巨大的影響，進而改變藥物與受體以及轉運體之間的相互作用，影響藥物代謝［7］。在不斷構建高密度SNP及相關藥物代謝的SNP圖譜的情況下，醫生了解患者基因型后，認真對患者遺傳檔案加以分析，并對患者進行適宜藥物的應用，以此避免藥物產生不良反應。目前，臨床所采用的藥物應用條件需要根據患者的體質量、年齡等資料加以確定，而在未來發展過程中，此方法會逐漸由個體遺傳信息取代。

2.3 人類進化史由于SNP對進化水平的變異有所體現，因此也可以對種群間的DNA序列變異進行研究。大多數SNP在基因組在蛋白質編碼區域之外，如分布方面是不會受到選擇的干擾，而且會長期保留下來。一些對蛋白編碼區域內的表現型SNP產生影響，雖然會受到自然選擇施加的壓力，但若是可以長時間被保留下來，就能夠對個體成功繁衍后代發揮促進作用，充分說明這些變異會受到選擇的干擾，而且還會作為代表成為進化史中的部分關鍵事件［9］。所以，根據對不同物種相互之間的蛋白編碼及非編碼區和變異數目得出的比值予以計算，能夠對進化樹當中的分支點加以追溯，還能促進進化，并產生積極影響的變異，這樣才可以在基因池中被固定保留。

3 研究方法與技術手段

在目前的SNP研究期間，很多技術會隨生物學實驗技術的進步發展而加以應用，具體表現為下面幾方面。

3.1 微陣列雜交實驗在SNP研究中可以將雜交實驗方法作為研究的基礎理論［10］。將SNP位點作為中心，再向兩側延伸10～20個堿基作為位點特異性探針，然后雜交包括該位點不同個體產生聚合酶鏈反應（PCR）的物質。該特異性探針具有較小的長度，所以可以對含有SNP位點堿基和靶DNA相匹配，從而對形成探針，也就是靶DNA復合物的穩定性產生關鍵作用，同時據此對不同個體位于此位點時表現的不同基因型加以辨別和對比。這種實驗方法具體有兩種模式，第一種適用于在規模較大的人群當中對少量SNP位點進行篩選，方法為將待測的DNA樣品進行固定；第二種可于同一時間對大批量SNP位點進行統一分析，方法為采用微陣列將高密度探針在基片上進行固定，并且要制備數萬個和ASO雜交以后PCR產物。如果可以實現這樣的操作，應該將每個SNP位點之間所產生的PCR盡可能縮短，保證能夠實現多重PCR。而且在PCR引物中應該存在通用尾巴，以利于二次擴增時，增加引物的使用效率，提高不同產物PCR的相似率［11］。當擴增完成以后，將點有ASO的基因芯片與包含多個SNP位點或是多重混合物的不同樣品實驗雜交，同時利用共聚焦顯微鏡技術檢測熒光信號并記錄，根據樣本間的對比及對照成像對雜交結果詳盡分析。此方法的問題主要是多重PCR具有一定程度的局限性，還有就是很多DNA樣本和ASO探針相雜交時存在的復雜性及設備與設計高密度芯片的問題。

3.2 分子燈塔這項技術基于PCR反應對SNP位點進行區分，并需要由3個部分組成的雜交探針，兩端為由熒光染料進行標記并可以參照SNP位點堿基的變化進行相應標記的DNA序列，中間為SNP位點的特異性序列。如果探針沒有和序列實施特異性雜交的情況下，探針兩端序列可以互補，從而產生發卡結構，致使兩側熒光材料因為過度緊密而發生熒光淬滅的現象［12］。如果探針和序列在特異性雜交的情況下，兩種染料各自分離，致使熒光強度變為雜交前的900倍以上。此種方法比較簡單便捷，但是探針雜交的穩定性卻不能滿足實驗的預期效果。

3.3 測序這種方法為國際上應用最為廣泛的SNP研究方法，具有直接、準確對序列差異進行反映、檢測成本逐漸降低等優勢。常用的手段就是PCR擴增產物的測序和隨機性測序。

3.3.1 PCR擴增產物測序 該種手段經常被應用于驗證及發現SNP中，利用PCR把可能調控區域和編碼區域里面的序列表現于不同個體中加以擴增以后，再對擴增后的產物予以序列或是測序分析。這種方法僅對已知序列組區域內的SNP開展研究，成本比較昂貴且操作復雜，也不適合對SNP進行大規模的篩選。

3.3.2 隨機測序 這種策略在目前的研究中流行兩種方法，基因組比與不完全鳥槍法。前者采取的方法為對全基因組進行隨機測序，并將其與人類基因組序列進行對比，將新發現的SNP在全基因組的序列圖譜中進行定位。缺點在于，在發現SNP的結果僅為2條染色體序列之間的比較，易導致數據分析時隨機誤差的產生和引入測序錯誤的出現，致使其產生假陽性的結果。不完全鳥槍法關鍵是把不同個體內的DNA樣品加以等量混合以后再構建基因文庫［13］。隨機性把全基因組核苷酸序列打斷為基礎，獲取全基因組內的微量片段，然后對其采取隨機測序，以至于其可以成倍的覆蓋，從而在不同顏色體間相互重疊的區域對序列差異加以驗證和發現，以利于搜索一些人群中的SNP。通常情況下，若是想把基因組內的部分區域取得比較大的覆蓋度，這就需要進行大量的測序反應達到目的，但是因為隨機測序方法內SNP選自不同個體構建的群體樣品，加強了結果的可信度。

4 人類單核苷酸多態性的研究現狀

根據現階段國際標準，SNP的試驗研究可以分為3個階段，分別是發現、驗證及篩選。而現在研究的重點傾向于第一個階段，而這一階段只能夠獲得與SNP有關的少量信息，例如多態位點在基因當中、染色體當中的定位，以及堿基的變異等。對于這個階段得到的SNP，還要在小規模人群中進行驗證，根據SNP的分布頻率對常見或稀有的類型進行判斷，以此來避免數據、實驗處理等方面產生假陽性的結果［14］。下一步實驗研究將選擇更廣闊的人群對SNP進行掃描，進一步確定不同人群中SNP的分布情況，同時尋找更低頻率的SNP。對于不同人群之間的關系以及遷移情況，SNP的分布頻率尤其是稀有SNP能夠起到重要的提示作用。按照進化的觀點可以總結出一個結論，常見SNP表明了變異相當久遠，在人群中長久的保存下來，而且以固定的頻率存在著；稀有的SNP表明，人群會在近期內出現變化。

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