椎間盤退變的基因治療

馬振江,丁 偉,張 凱,趙 杰

下腰痛是一種常見病、多發病，它影響人們的生活質量和精神狀態，成為困擾人類的疾病之一[1-3]。很多因素都會導致下腰痛，其中椎間盤退變是最重要的因素之一[4]。目前臨床上針對椎間盤退變引起相關疾病的治療策略是解除椎間盤退變相關的脊髓、神經和血管刺激或壓迫，并非針對椎間盤退變的病理過程，因而臨床癥狀可反復發作，而且手術后病變節段的相鄰節段椎間盤退變加速[5-6]。隨著科學技術的發展，特別是分子生物學技術不斷進步，延緩甚至逆轉椎間盤退變正成為可能。目前治療椎間盤退變的分子生物學技術主要包括三大類：細胞治療、組織工程治療及基因治療。本綜述主要著重基因治療。

1 椎間盤退變的病理機制

椎間盤由髓核、纖維環和軟骨終板構成，其主要成分是椎間盤細胞和細胞外基質。軟骨終板由圓形軟骨細胞組成。纖維環細胞分為3層，外層呈梭形，內層與軟骨細胞相似，中間層則是移行帶。髓核細胞在幼兒時主要由脊索細胞組成，成年時則逐漸被纖維軟骨所取代。椎間盤細胞的密度較大多數組織細胞密度低，細胞分布也不均勻，細胞外基質主要由膠原、蛋白多糖和彈性蛋白組成。正常情況下纖維環中含有Ⅰ型膠原，主要是抗張力；髓核含有Ⅱ型膠原，主要是抗壓力。蛋白多糖是椎間盤主要的大分子結構，包括硫酸軟骨素、硫酸角質素和透明軟骨素等，主要作用是維持椎間盤水分、濃度、滲透壓、正常代謝和均勻分布應力。彈性蛋白與膠原纖維一樣固定椎間盤，具有彈性，起震蕩吸收作用。椎間盤是一封閉結構，內無血管，椎間盤細胞只能靠溶質彌散獲取營養，這不利于損傷修復。但在封閉相對缺血的環境下卻可避免發生自身免疫反應。這使得基因療法的應用比其他組織更具優勢。

到目前為止，椎間盤退變的確切機制尚不清楚，眾多因素(包括遺傳、生化和生物力學等)都可能引起椎間盤退變[7]。過去觀念認為椎間盤退變主要與環境因素有關，比如司機駕車時震動[8]，舉重運動員抓舉重物[9]，缺少運動鍛煉的生活方式[10]。此外吸煙或者創傷也被認為是重要因素之一[7-8]。但目前最新觀點認為椎間盤退變過程中，遺傳因素的作用占70%，而其他環境因素的作用只占30%[11]。椎間盤退變最主要的標志是蛋白多糖的進行性減少，這與氧張力降低、自由基增加、PH降低、蛋白溶解酶增加有關[11-12]。由于蛋白多糖的丟失，髓核不能保持正常的流體靜力壓，最終導致椎間盤脫水變性[13]。另外，椎間盤中膠原的比例也發生改變，Ⅱ型膠原逐漸減少。最終導致纖維環和髓核發生退變，進而影響椎間盤的生物力學特性[14-15]。

很多研究表明蛋白多糖的減少是分解代謝和合成代謝不平衡所致，原因在于基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解聚素樣金屬蛋白酶表達上調，同時膠原和蛋白多糖的合成減少[16-17]。隨著分子生物學的技術不斷進步，基因治療在改變椎間盤細胞代謝和生物力學性能方面發揮著重要作用。

2 基因治療

基因治療是指將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償基因缺陷和異常以治療相關疾病，也就是將外源基因通過基因轉移技術插入患者適當的受體細胞中，通過外源基因制造的產物治療某種疾病。具體到椎間盤的基因治療，包括以下幾部分：①充分明確椎間盤退變的機制；②目的基因的選擇與修飾；③轉基因載體的選擇與應用；④轉基因的調控。根據對靶細胞處理方法的不同分為2種：一是直接基因療法；二是間接基因療法。直接基因療法操作比較簡單，但是安全性較差，而間接基因療法操作復雜，細胞特性容易發生改變，基因表達不一定滿意，但是比較安全。Wehling等[18]1997年首次報道逆轉錄病毒作為載體攜帶β-半乳糖苷酶和白介素受體-1拮抗劑基因轉染牛軟骨細胞，48 h后盡管只有1%細胞被轉染，但是白介素受體-1拮抗劑基因較對照組表達增加。這是首次提出應用間接基因療法治療椎間盤退變。基因轉移至靶細胞一般有以下方法：①電穿孔法；②顯微注射法；③粒子轟擊法；④超聲波法；⑤磷酸鈣共沉淀法。

2.1 基因治療載體

轉基因載體是研究基因治療中最重要和最艱難的部分之一。理想的基因載體具有以下特征：①容易進入靶細胞；②能夠在靶細胞中持續高水平表達；③外源性基因含有自主復制的構件或整合于基因組活化區; ④操作比較安全；⑤容易大量生產[17]?；蜉d體分為兩大類：一類是病毒載體，其轉染效率高，基因表達水平高，持續性好，但是毒副作用大，安全性差，比如腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、細小RNA病毒等；一類是非病毒載體，轉染效率及表達水平不高，但是安全性較好，比如脂質體和DNA配體復合物。目前病毒載體是椎間盤細胞的首選載體，其中腺病毒、腺相關病毒、慢病毒載體應用較多，具體如下。

2.1.1 腺病毒載體

腺病毒為線性雙鏈DNA，分為6個亞屬，近50個亞型。目前主要用以構建載體的是2型和5型腺病毒，其能夠轉染分裂細胞和非分裂細胞，病毒基因并不整合到宿主細胞，所以其選擇的范圍很廣。1998年Nishida等[19]首次應用腺病毒載體介導，將標記基因LacZ轉染體內外兔椎間盤髓核細胞。體外實驗發現基因LacZ全部表達，無明顯細胞毒性，而且基因LacZ持續表達3周未減退。體內實驗證明基因LacZ不僅局限在注射部位而且彌漫到周圍椎間盤，持續穩定表達12周，組織學上未發現明顯炎癥改變。以上表明腺病毒載體轉染椎間盤細胞是可行的。1999年Nishida等[20]再次報道應用腺病毒載體介導，將基因hTGF-T1轉染體內的兔椎間盤髓核細胞,免疫組化提示轉染的髓核細胞中hTGF-T1的表達比對照組增加5倍，同時蛋白多糖的含量增加了1倍。此實驗進一步證明腺病毒載體轉染椎間盤細胞是可行的。2000年Moon等[21]報道應用腺病毒載體介導，將基因LacZ和熒光素酶轉染退變和未退變的椎間盤細胞，結果表明椎間盤細胞達到100%轉染，需要的最小病毒量是150 mol,同時在退變和未退變的細胞中熒光素酶活性沒有明顯差異。此實驗首次證實腺病毒載體轉染人椎間盤細胞可行，為進一步治療人椎間盤退變提供了一種途徑。但是由于腺病毒載體不整合到宿主細胞，同時容易產生抗原，進一步導致應答反應，故其表達時間不是很長[22]。有學者使用腺病毒作為載體嘗試轉染牛髓核細胞，使其表達多種骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)和Sox9基因，此研究表明，經過BMP-2和BMP-7轉染的牛髓核細胞能合成大量的多聚糖蛋白[23]。

2.1.2 腺相關病毒載體

腺相關病毒為線性單鏈DNA，無致病性，其基因組的整合對細胞的復制無任何不良影響，可以在19號染色體上進行定點特異整合，穩定性好，且能轉染分裂細胞和非分裂細胞，但病毒小，最大插入列僅4.5 kb，而且不容易獲得高滴度。Lattermann等[24]的一項實驗，分別在體內、體外比較腺病毒和腺相關病毒載體轉染髓核細胞的效率，腺相關病毒載體表達時間長達6周，而且目的基因LacZ表達水平也較高。盡管腺相關病毒有很多缺點，但目前仍受到很多關注

2.1.3 慢病毒

慢病毒是一種逆轉錄病毒，以人類免疫缺陷I型病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)為基礎發展起來的基因治療載體，與一般的逆轉錄病毒載體不同，既能感染分裂細胞又能感染非分裂細胞，同時保留了整合到宿主染色體上的特點，可轉移較大的基因片段、目的基因表達時間長、而且不易誘發宿主免疫反應[25]。

2.2 椎間盤細胞的相關基因

研究表明許多細胞因子與膠原、蛋白多糖有關。膠原和蛋白多糖隨著時間的延長會逐漸失去彈性和張力，進而水含量減少，使得細胞外基質承受過度負荷，導致基質降解，椎間盤發生變形，生物力學性能發生改變，最終導致椎間盤退變。根據作用的不同將細胞因子分為4類：①抗分解代謝因子，如MMP抑制劑、白介素-1受體拮抗劑；②促細胞分裂因子，如胰島素生長因子、生長分化因子；③骨誘導形成細胞因子，如骨形態發生蛋白；④細胞內調節因子，如軟骨特異性基因Sox-9。典型因子具體如下。

2.2.1 抗分解代謝因子

MMP組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)家族目前發現有4種：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1具有多種生物學功能，并且在細胞外基質改建和椎間盤病理過程中發揮生物學作用[26]。其主要是對MMP的抑制作用，并能促進細胞增殖抑制細胞凋亡[27]。Sobajima等[28]報道兔椎間盤退變早期TIMP1表達下降，3周后表達量約為退變前的10%，此研究表明早期可以向椎間盤注射TIMP1以延緩退變。Wallach等[29]報道腺病毒載體轉染TIMP1基因和BMP-2基因，結果表明細胞外基質降解減少，同時TIMP1與BMP-2促進細胞合成代謝效果相當。

2.2.2 促細胞分裂因子

2.2.2.1 胰島素生長因子(insulin like growth factor， IGF)

IGF-1具有促進軟骨細胞分泌細胞外基質的作用，同時通過降低MMP-2來減少細胞外基質的降解。Osada等[30]應用原位雜交方法證實髓核細胞中有IGF-1 mRNA表達，同時這些細胞有自分泌和旁分泌功能。Gruber等[31]2002年報道將體外單層培養的椎間盤細胞加入IGF-1，細胞凋亡延緩。Allen等[32]2005年報道IGF-1通過調控Bcl/Bax平衡或者磷脂酰肌醇3-激酶和原蛋白激酶有絲分裂通路來抑制細胞凋亡。

2.2.2.2 BMP

BMP屬于轉化生長因子β(transforming grouth factor-β,TGF-β)超家族成員，目前主要研究BMP-2和BMP-7。BMP-2是一種多功能生長因子，能刺激細胞外基質合成，調節細胞生長分化和凋亡，對軟骨形成和維持細胞表型有重要作用。Kim等[33]報道重組BMP-2能促進人退變椎間盤細胞Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原mRNA的表達和蛋白多糖合成。Li等[34]2004年報道在大鼠椎間盤細胞加入BMP-2后Ⅱ型膠原mRNA的表達和蛋白多糖合成增加，TGF合成也增加。Gamradt等[35]2006年報道成功應用腺病毒載體攜帶重組BMP-2基因轉染兔骨髓細胞并在體內持續表達12周。綜上，重組BMP-2可以延緩甚至逆轉椎間盤退變。BMP-7又稱成骨蛋白,對膠原合成及蛋白質合成積聚起刺激作用。Takegami等[36]2002年報道BMP-7促進蛋白多糖合成，還能通過抑制白介素-1減少蛋白多糖分解。An等[37]2005年報道向正常兔椎間盤中注射BMP-7，2周后注射組椎間盤高度較對照組增加15%，4～8周后效果仍顯著。以上結果表明重組BMP-7可以促進蛋白多糖合成。

2.2.3 TGF-β

TGF-β是目前研究最廣也是最深入的一種細胞因子。它是一種具有多種功能的蛋白多肽，廣泛存在于動物正常組織細胞以及轉化細胞中。Thompson等[38]一項體外實驗中，外源性TGF-β1促進犬髓核細胞蛋白多糖合成，這也是首次應用細胞因子延緩椎間盤退變。此后，不斷有報道提示TGF-β促進椎間盤細胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

2.2.4 細胞內調節因子

Sox-9基因是Sox基因家族成員之一，軟骨細胞Ⅱ型膠原合成過程的關鍵轉錄因子。Paul等[39]2003年報道將Sox-9基因轉染至兔退變的椎間盤細胞中，5周后Ⅱ型膠原合成增加，軟骨細胞維持原有表型，而對照組中髓核細胞的數量已經下降，并被成纖維細胞取代。2007年Liu等[40]報道通過重組病毒Sox-9基因轉染至退變的椎間盤細胞中結果提示Sox-9基因可以在體內表達。以上結果表明Sox-9基因能夠延緩椎間盤的退變。

2.3 基因治療的安全調控

引入非特異性基因的治療模式中應用較多的是cDNA。它是一種結構基因，自身沒有調控表達的能力，這種基因的表達調控依賴于轉基因的載體。同時基因表達的調控具有多層次性，其中轉錄水平調節是基因表達的基本控制點。它包括啟動子、增強子、沉默子、加尾PolyA信號等[41]。由于基因載體大多數都是病毒，不可避免的都有毒副作用，因此需要病毒的量盡可能少。Moon等[42]2008報道人髓核細胞在體內外分別予以腺病毒載體TGF-β1、BMP-2、IGF-1單獨或者聯合轉染，結果提示蛋白多糖在使用單一治療基因時增加180%～295%，而在聯合使用2種治療基因時蛋白多糖增加322%～398%，更令人鼓舞的是，聯合使用3種治療基因時蛋白多糖增加471%。將來的研究趨勢是否能夠與抗分解因子聯合使用來進一步減少病毒量。另外，當前還有一些轉基因表達系統，比如熱休克蛋白、類固醇激素啟動子、四環素等。這些表達系統大多數都是通過活化載體上的治療基因，類似于開關系統。Chtarto等[43]2003報道使用四環素調節系統調節腺相關病毒載體轉染。Ueblacker等[44]2004年報道應用四環素調節系統在兔骨軟骨缺損模型中獲得成功。下一步的目標是使四環素系統更加高效、加載藥量更小、副作用更小。

另外，目前比較流行的RNA干擾技術，可以特異性剔除或關閉特定基因的表達。因此在椎間盤退變中將促分解代謝因素的基因抑制或者降低表達是另外一種可選擇的治療途徑。Kakutani等[45]2006年報道使用RNA干擾技術分別在體外培養大鼠和人髓核細胞，結果提示大鼠中熒光酶基因表達下降94.7%，在人髓核細胞中熒光酶基因表達下降93.7%，并且這種抑制效應持續3周。

3 展 望

自從1997年Wehling等首先提出轉基因逆轉椎間盤退變的設想，椎間盤退變基因治療研究已達16年，目前仍處于實驗研究初級階段，要真正運用于臨床仍需要深入開展大量的研究工作。具體一些策略如下：①進一步明確椎間盤退變的分子生物學機制，找出更多的相關基因。②深入研究目前關注的一些細胞因子cDNA轉染椎間盤細胞后的表達及其副作用，以進一步證明其在基因治療方面上的臨床意義。③尋找新的更有效的細胞因子，同時研究各種細胞因子之間的相互作用，在此基礎上嘗試多基因轉移的可能性。④深入研究外源性基因表達調控，使得目的基因適時適量表達，最終發揮生物效應。⑤目前采取的病毒載體在轉染椎間盤細胞方面存在一些問題，需通過不斷改進逐步解決一些困難，同時努力開發新的更高效更安全的載體。⑥探索和改進組織工程技術，在基因轉移的策略上堅持從間接基因療法上突破。⑦擴大基因治療模式，如基因增補或者反義技術等。

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