血必凈對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用

張之齡，童小文，徐兵，朱健

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上海200011)

血必凈是在古方血府逐瘀湯基礎(chǔ)上精煉出的復(fù)方中藥靜脈制劑，由中藥赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸的提取物組成，具有良好的活血化瘀、疏通絡(luò)脈、潰散毒邪的作用。本研究通過大鼠靜脈注射脂多糖(LPS)致膿毒癥肺損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2.5～3.5月齡健康雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量250～280 g/只，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2008－0016］。

1.2 主要試劑與儀器 脂多糖(Escherichia coliO127:B8，L3129，Sigma，美國(guó));大鼠 TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(R＆D，美國(guó)，上海玉博公司分裝);血必凈注射液(規(guī)格10 mL/支，天津紅日藥業(yè)有限公司);生物光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本);全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x(Raduometer ABL800，丹麥)。

1.3 模型制備與標(biāo)本收集 以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射將大鼠麻醉后固定，經(jīng)大鼠股靜脈按5 mg/kg注射 LPS。45只 SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠隨機(jī)分為三組:健康對(duì)照組(n=15)，脂多糖組(LPS組，n=15)，血必凈組(XBJ組，n=15)。血必凈組在造模前半小時(shí)靜脈內(nèi)給予血必凈4 mL/kg，健康對(duì)照組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各組隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組，留取大鼠肺組織、抗凝動(dòng)脈血及血清待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 動(dòng)脈氧分壓測(cè)定 腹主動(dòng)脈取血0.5 mL，血?dú)夥治鰞x測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血氧分壓(PaO2)。

1.4.2 肺組織濕/干重比(W/D)測(cè)定 大鼠右肺上葉組織，濾紙吸干表面水分，置于一干燥潔凈的玻璃試管中，經(jīng)電子天平精確稱重后，置于70℃恒溫烤箱內(nèi)，烘干72 h后再稱重，計(jì)算前后兩者的比值為肺濕/干重(W/D)比。

1.4.3 肺組織病理觀察及ALI病理評(píng)分 留取右肺下葉，4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。按照Mikawa的方法［1］進(jìn)行肺組織病理半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):對(duì)①肺泡充血，②出血，③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集，④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四項(xiàng)指標(biāo)，分別依病變輕重評(píng)0～4分(0分指無病變或非常輕微病變，1分指輕度病變，2分指中度病變，3分指重度病變，4分指極重度病變)，總分16分;四項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)總和為肺損傷的總評(píng)分。

1.4.4 血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè) 心臟采血1 mL，靜置30 min后再以3500 r/min離心15 min，取上清液置于－20℃ 冰箱保存，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定血清TNF-α濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包分析，多組均數(shù)采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 LPS組大鼠PaO2較對(duì)照組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)顯著下降(P＜0.05)，于6 h時(shí)間點(diǎn)有所下降，12 h下降明顯，24 h呈現(xiàn)嚴(yán)重的缺氧狀態(tài)，PaO2跌至(58.0 ±3.16)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。XBJ組動(dòng)脈PaO2各時(shí)間點(diǎn)較LPS組明顯升高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組動(dòng)脈血氧分壓PaO2結(jié)果的比較(±s，mm Hg)

表1 各組動(dòng)脈血氧分壓PaO2結(jié)果的比較(±s，mm Hg)

注:與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05;與LPS組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05

組別 鼠數(shù)(只)Ⅰ亞組(6 h)Ⅱ亞組(12 h)Ⅲ亞組(24 h)5 94.0 ±1.87 93.6 ±3.71 94.4 ±1.14 LPS 組 5 73.2 ±2.38a61.2 ±3.49a58.0 ±3.16a XBJ組 5 84.0 ±2.28ab76.0 ±1.58ab72.6 ±2.07對(duì)照組ab

2.2 肺組織W/D比值測(cè)定 與對(duì)照組相比，LPS組大鼠W/D隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)而上升，24 h達(dá)NS組同時(shí)間點(diǎn)的1.73倍，XBJ組W/D亦隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)而上升，但明顯低于LPS組同時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 肺組織濕/干重比值的比較(±s)

表2 肺組織濕/干重比值的比較(±s)

注:與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05;與LPS組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05

組別 鼠數(shù)(只)Ⅰ亞組(6 h)Ⅱ亞組(12 h)Ⅲ亞組(24 h)5 4.12 ±0.08 4.25 ±0.17 4.32 ±0.21 LPS 組 5 5.64 ±0.75a6.21 ±0.90a7.46 ±0.82a XBJ組 5 4.62 ±0.24ab4.98 ±0.16ab6.03 ±0.42對(duì)照組ab

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化及ALI病理評(píng)分 光鏡下，健康對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔無水腫、無炎癥，肺泡腔清晰。且各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異;LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本消失，肺泡隔增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。且隨時(shí)間點(diǎn)增長(zhǎng)而明顯。XBJ組大鼠肺組織肺泡隔略有增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。三組大鼠ALI病理評(píng)分結(jié)果見表3。

2.4 血清TNF-α測(cè)定結(jié)果 致炎后6 h，LPS組血清中TNF-α的濃度大幅上升(P＜0.05)，6 h后回落，12～24 h時(shí)與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);XBJ組致炎后6 h的TNF-α的濃度也大幅上升，但明顯低于LPS組(P＜0.05)，6 h后與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表3 各組大鼠病理半定量評(píng)分的比較(±s)

表3 各組大鼠病理半定量評(píng)分的比較(±s)

組別 鼠數(shù)(只)Ⅰ亞組(6 h)Ⅱ亞組(12 h)Ⅲ亞組(24 h)5 1.0 ±0.7 1.2 ±0.8 1.4 ±0.9 LPS 組 5 11.2 ±1.1a 13.0 ±0.7a 13.4 ±0.9a XBJ組 5 9.2 ±1.1ab 10.4 ±1.1ab 10.8 ±1.1對(duì)照組ab

表4 各組大鼠血清中TNF-α的濃度(±s，pg/mL)

表4 各組大鼠血清中TNF-α的濃度(±s，pg/mL)

注:與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05;與LPS組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05

組別 鼠數(shù)(只)Ⅰ亞組(6 h)Ⅱ亞組(12 h)Ⅲ亞組(24 h)22.6 ±6.8 17.2 ±7.2 5 15.3 ±6.4 17.3 ±7.5 18.5 ±8.5 LPS 組 5 56.6 ±8.9a 27.3 ±10.6 21.2 ±5.9 XBJ組 5 35.2 ±10.8ab對(duì)照組

3 討論

經(jīng)過長(zhǎng)期大量的基礎(chǔ)和臨床驗(yàn)證，血必凈注射液能拮抗內(nèi)毒素［2］及 IL-1、IL-6［3］的釋放，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［4］，增強(qiáng)單核細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原(HLADR)表達(dá)，促進(jìn)免疫功能恢復(fù)［5］，清除氧自由基，改善組織灌注及微循環(huán)，從而能夠控制全身炎癥反應(yīng)，可明顯減輕膿毒癥大鼠腎組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球淤血和腎小管上皮細(xì)胞損傷，防止腎血管微血栓形成，并可阻止損傷范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。降低BUN和Cr水平，顯示出對(duì)腎功能明顯的保護(hù)作用，因此其對(duì)組織器官保護(hù)作用越來越受到人們的重視［6］。

本研究結(jié)果顯示:①血必凈預(yù)處理可以提高大鼠LPS致炎后6 h、12 h和24 h的PaO2;②血必凈預(yù)處理可以降低大鼠LPS致炎后6 h、12 h和24 h的W/D比值;③血必凈預(yù)處理可以降低致炎后6 h、12 h和24 h的肺組織病理半定量評(píng)分比值;④肺組織病理切片顯示，血必凈預(yù)處理可以減輕肺組織結(jié)構(gòu)毀損以及中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度;⑤ELISA結(jié)果顯示，LPS致炎后6 h，大鼠血清中TNF-α的濃度即達(dá)到峰值，血必凈預(yù)處理可使血清中TNF-α濃度峰值下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:血必凈預(yù)處理能顯著抑制大鼠在ALI初期TNF-α的釋放。

膿毒癥病情是較為復(fù)雜的，有多種病因，人體有不同的癥狀和體征［7-9］。有人報(bào)道凝血異常在疾病的最初階段起了重要的作用，可以引起肺內(nèi)血管損傷及微血栓的形成［10-12］。血必凈具有活血化瘀作用，參與抗凝的過程;血必凈中川芎、丹參、紅花有抑制內(nèi)毒素血癥大鼠微血栓形成的作用，通過其抗凝活性來減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血必凈預(yù)處理可減少血清中TNF-α的釋放，抑制肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，使LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷大鼠動(dòng)脈血?dú)狻⒎蜽/D比值及肺組織病理半定量評(píng)分得到一定程度的改善，表現(xiàn)為對(duì)肺組織有一定的保護(hù)作用。

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