病理技術因素對甲狀腺結節P-FNAC診斷準確性的影響

黃卡特 肖維華 陳霖 余霞 吳亮

病理技術因素對甲狀腺結節P-FNAC診斷準確性的影響

黃卡特 肖維華 陳霖 余霞 吳亮

目的 評估影響甲狀腺結節觸診細針穿刺細胞學診斷（P-FNAC）準確性有關的病理技術因素。 方法 收集行P-FNAC檢查并經外科手術切除的甲狀腺結節患者136例，回顧其活檢和細胞學結果，將患者分成5等級：1級，不確定14例；2級，良性48例；3級，不典型23例；4級，可疑惡性24例；5級，惡性27例；其中4和5級視為陽性，1、2和3級視為陰性。探討不同穿刺技巧、制片和染色因素對P-FNAC檢查診斷準確率的影響。 結果 P-FNAC的陽性準確率為79．41%，敏感度84．31%，特異度76．47%，陽性預測值為68．25%，陰性預測值為89．04%。是否血液稀釋對診斷甲狀腺惡性結節有較明顯影響（P＜0．05）。Logistic多元回歸分析結果證實穿刺次數、血液稀釋以及染色類型對P-FNAC陽性率有顯著影響（P＜0．05或0．01）。 結論 規范P-FNAC穿刺操作及染色技術對甲狀腺結節診斷準確性具有重要作用。

甲狀腺結節 細針穿刺 細胞學 技術

甲狀腺結節觸診法細針穿刺細胞學檢查（palpable fine-needle aspiration cytology，P-FNAC）為近年發展起來的一種簡便快速并較為準確的診斷方法，是病理科診斷細胞學的一個重要手段，其對直徑＞1cm的甲狀腺惡性結節具有較大的診斷價值。P-FNAC技術操作流程中仍然存在如穿刺數量、涂片方法、固定和染色技巧等諸多因素影響，這些技術因素能否影響FNAC檢查甲狀腺結節的準確性，目前國內外文獻尚未見大宗病例報道。為提高P-FNAC技術操作水平，筆者回顧了行P-FNAC檢查的136例患者臨床資料，并對手術病理活檢結果進行比較，分別評估上述因素對甲狀腺P-FNAC準確性的影響，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧2008-02—2013-07溫州醫科大學附屬第一醫院病理科行甲狀腺P-FNAC 136例患者的臨床及病理資料。其中男59例，女77例，男︰女=1︰1.3；年齡12～85歲，中位年齡47.0歲。

1.2 方法

1.2.1 準備材料 甲狀腺細針穿刺包（內含彎盤，國產一次性使用塑料無菌10 ml注射器及22G針頭，紗布5塊）；標本瓶（內盛95%乙醇或甲醇），潔凈載玻片3～5張；蘇木精-伊紅（HE）染液和Diff-quick（DQ）快速染液。薄層液基細胞學制片儀（新柏氏）、細胞學保存液和一次性樣本收集管。其他用品如下：無菌換藥包、無菌橡膠手套、急救包等。

1.2.2 觸診穿刺方法 患者取平臥位，穿刺前先觸診甲狀腺，局部0.5%碘伏消毒，左手食指和中指固定穿刺側甲狀腺結節，右手持10ml玻璃注射器接（22G）針頭，與皮膚角度＞45°，經皮膚快速刺入甲狀腺結節內，多方向快速來回穿刺2～3次，拔出穿刺針。

1.2.3 取材方法 （1）負壓抽吸法：針筒保持無氣狀態刺入腫物，拉回針栓，始終保持負壓，抽吸完畢，釋放負壓，拔針，推出吸出物于載玻片上，涂片。（2）非負壓抽吸法：采用非負壓方式刺入病灶，快速穿刺取樣，若有出血立即拔針，若腫塊內為液體，盡量將液體全部吸出。

1.2.4 P-FNAC涂片技術 （1）普通涂片：穿刺后，將針頭內的吸出物直接均勻排放于載玻片上，液體多者用玻片或蓋玻片均勻涂開。涂片采用厚薄兩種方式，前一種速度較慢，后者速度快。（2）薄層液基涂片：將注射器內穿刺物直接洗入裝有25～30ml的固定液小瓶中。小瓶放入振蕩器震蕩15min，采用薄層液基細胞制片儀制片。

1.2.5 P-FNAC固定技術 采用95%乙醇或甲醇固定。固定有2種方式，一種為濕固定——趁標本新鮮而又濕潤時，迅速放入盛有固定液的固定缸內至少保持1min；另一種為干固定——使用吹風機將涂片吹干后或自然風干后再固定。

1.2.6 P-FNAC染色技術 主要使用HE染色。DQ染色屬于浸沒式染色，染色時間1min。薄層液基涂片處理：將涂片入95%乙醇5min行HE染色或甲醇溶液固定1min后行DQ染色，部分乙醇固定病例采用DQ染色。

1.3 標本滿意度判斷標準 樣本滿意度參考Haider提供的判斷標準[1]，即鏡下有足夠數量的有效細胞（≥6組細胞，每組≥10個細胞或總共≥60個孤立細胞）。PFNAC穿刺抽吸物太少、標本處理或制備不佳，導致不能作出細胞學診斷者視為不合格樣本。

1.4 結果判讀及分組依據 參考巴氏細胞病理學協會提供的Bethesda判讀標準（TBSRTC）[2]和意大利病理學與細胞學協會（SIAPEC）共識會議關于甲狀腺細針穿刺相關診斷標準[3]，結合實際情況將細胞學結果診斷分為5個等級組：1級，不確定；2級，良性；3級，不典型；4級，可疑惡性；5級，惡性。其中4和5級視為陽性，1、2和3級視為陰性。將術后病理活檢結果作為判定PFNAC真陽性或真陰性結果的金標準，分為良性病變和惡性病變。

1.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料的比較采用χ2檢驗；多變量統計分析采用多元logistic回歸法。

2 結果

2.1 甲狀腺結節P-FNAC細胞學與相關病理技術參數分布情況 見表1。

表1 甲狀腺結節P-FNAC細胞學與相關病理技術參數分布情況（例）

由表1可見，行單次穿刺數量占58.8%，雙次穿刺占41.2%。涂片采用厚涂片占47.8%，薄涂片占52.2%。制片方式采用普通涂片和液基涂片，分別占63.2%和36.8%。有血液稀釋者占46.3%，無血液稀釋者占53.7%。固定采用95%乙醇和甲醇兩種類型，分別占61.8%和38.2%。固定方式采用干固定者占33.8%，濕固定占66.2%。采用HE染色者占61.8%，DQ染色占38.2%。136例病例中，不確定病例占10.3%（14/136），良性病例占35.3%（48/136），不典型病例占16.9%（23/136），可疑惡性病例占17.6%（24/136），惡性病例占19.8%（27/136）。

2.2 P-FNAC陽性比例分布、總體準確率、敏感度、特異度及預測值 見表2。

由表2可見，136例P-FNAC樣本中，陽性51例，占37.5%，陰性85例，占62.5%。活檢陽性63例（46.3%），陰性73例（53.7%）。P-FNAC的陽性準確率為79.41%，敏感度84.31%，特異度76.47%，陽性預測值為68.25%，陰性預測值為89.04%，假陽性率5.88%。

表2 P-FNAC和手術活檢陽性率和陰性率比較（例）

2.3 P-FNAC檢查與病理活檢陽性例數差異性單因素分析 見表3。

表3 P-FNAC檢查與病理活檢陽性例數差異性比較分析

由表3可見，各參數中僅是否血液稀釋對診斷甲狀腺惡性結節有較明顯影響（P＜0.05）。對亞參數進行統計分析發現，假陽性率較高的參數有單次穿刺、存在血液稀釋和DQ染色，假陽性率分別為3.68%、3.68%、4.41%，診斷符合率分別為122.73%、240.00%和150.00%。2.4 P-FNAC相關技術參數logistic多元回歸分析 以術后病理活檢結果為獨立應變量，將穿刺次數、涂片厚度、制片方式、血液稀釋、固定類型、固定方式和染色類型等自變量參數進行logistic多元回歸分析，結果證實對診斷甲狀腺惡性結節有顯著影響的獨立相關變量包括：穿刺次數、血液稀釋以及染色類型，詳見表4。

表4 logistic多元回歸分析結果

3 討論

FNAC基本原理是利用細針小針頭斜面對靶組織進行往復式切割，使組織被切成微小的微粒組織或細胞懸液，再進行涂片、染色、病理診斷[4]。對直徑＞1cm的甲狀腺結節，有經驗的病理科醫師通常會參考臨床病史及超聲檢查，采用觸診法行穿刺，而不依賴超聲引導。實際工作中我們發現，除病理醫師經驗影響外，還有很多采集和制作樣本的諸多病理技術因素影響病理結果的準確性。

P-FNAC對甲狀腺惡性結節的診斷符合率在80%以上，國外報道其確診率可達90%以上[5]。本組P-FNAC活檢的陽性準確率為79.41%，敏感度84.31%，特異度76.47%，陽性預測值為 68.25% ，陰性預測值為89.04%，與Rangaswamy等[6]研究結果的敏感度75.60%、陽性預測值83.78%較為接近；但與國外其他文獻[7-9]相比較有明顯差異，可能原因：（1）國外的FNAC技術采用了更為嚴謹的雙重模式有關，包括主要分類模式和次級再分類模式，更具有準確性、穩定性和可重復性；（2）國外的相關研究大多采用了超聲引導的FNAC（US-FNAC），而不是P-FNAC，但后者目前更適合在我國病理科細胞學專業組開展。

對于不滿意的樣品要進行重復穿刺，這是P-FNAC檢查的一種重要手段。本研究發現，單次和雙次重復甲狀腺P-FNAC檢查陽性率與組織學陽性率比較未見明顯差異，但多元回歸分析發現，重復穿刺反而降低了檢出率，可能與二次穿刺損傷出血稀釋有關，因為血液稀釋無論單因素和多因素分析均提示對FNAC檢查準確性影響最為突出。Maqbali等[10]的研究結果也支持了上述發現，即甲狀腺惡性結節重復FNAC檢查有一定局限性，第1次穿刺無法診斷病例僅占15.9%，第2、3次重復FNAC操作無法診斷率分別為61.8%和47.2%。Melillo等[11]和Gabalec等[12]的研究均認為重復FNAC僅適用于樣本量偏少的可疑惡性或不典型病變，以便進行適當和積極的臨床治療。除重復穿刺外，P-FNAC針吸取樣本過程中加負壓也可能導致血液稀釋的發生，但加負壓FNAC較非負壓操作能采集到更多的細胞量而有助于診斷，目前采用負壓FNAC檢查對血液稀釋狀態的影響在學術界[13]尚存在爭議。假陽性是指FNAC結果為惡性，但術后標本中并未發現。本組研究也出現一定的假陽性率，為5.88%。出現假陽性結果的原因可能與制片所致細胞重疊、退行性改變、標本固定不佳或細胞病理學醫師缺乏經驗等因素有關。P-FNAC是一種抽樣檢查，屬于盲穿，抽吸組織少可能不在真正病變部位，有時會出現假陽性或假陰性結果，因此我們必須高度重視和理解P-FNAC操作的規范性和熟練程度,對流程關鍵技術可變因素進行穩定性專業培訓。Swamy等[14]研究分別發現有4例假陽性和6例假陰性FNAC診斷，最后考慮主要是由于抽樣誤差造成的。本組研究結果表明液基細胞學制片與常規涂片制片相比并未表現出明顯優勢，但液基細胞學在甲狀腺FNAC檢查的良好觀察視野更有利于識別膠質和非典型細胞核，減少非惡性病變的不確定診斷，即能降低假陽性應用優勢是明顯的[15-17]。固定對FNAC檢查是重要的，干濕固定各有優缺點，其中干固定染色特點為細胞收縮程度低，細胞質形態清晰，細胞核較大，但無法看清核的細微結構易誤診為癌而出現假陽性。而濕固定的HE涂片染色，質量較好，結構清晰，細胞核的結構表現尤其突出，但濕固定缺點是當液體量多時，穿刺標本中癌細胞的特征可能不如干固定明顯，在固定過程中可能會丟失一部分細胞或成團細胞簇，較多的細胞數量很可能有助于增加FNAC陽性檢出率。

綜上所述，觸診法細針穿刺細胞學檢查是通過多種病理技術手段,并以細胞學為基礎的病理檢查,它是一項微創性檢查，具有一定的缺陷和不足，尤其診斷前穿刺技巧、涂片、固定和染色是不能忽視的因素。甲狀腺PFNAC操作是否熟練和規范，將直接影響診斷的準確率。

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Influencing factors on diagnostic accuracy of palpable fine-needle aspiration cytology in thyroid nodules

Objective To evaluate the influencing factors on diagnostic accuracy of palpable fine-needle aspiration cytology(P-FNAC)in thyroid nodules．Methods One hundred thirty-six patients with thyroid nodules underwent surgical resection,preoperative P-FNAC was performed in all patients．According to cytological results of biopsy,the patients were classified as:grade 1(undifined,n=14),grade 2(benign,n=48),grade 3(atypical,n=23),grade 4(suspicious malignant,n=24),grade 5 (malignant,n=27),among which grades 4 and 5 were taken as positive and grades 1-3 as negative．The influence of aspirating technique,slide-making and staining on diagnostic accuracy of P-FNAC was evaluated．Results The overall accuracy rate of palpable FNAC was 79．41%．The sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of P-FNAC were 84．31%,76．47%,68．25%and 89．04%,respectively．Layered chi-square test showed that hemodilution significantly affected the diagnostic accuracy for malignant thyroid nodules(P＜0．05)．Multiple logistic regression analysis revealed that the times of aspiration,hemodilution and types of staining significantly affected the accurate rate of P-FNAC(P＜0．01 or 0．05)．Conclusion To improve the diagnostic accuracy of thyroid nodules it is necessary to standardize the aspiration procedure and staining technique of P-FNAC．

Thyroid nodule Fine-needle aspiration Cytology Technique

2014-01-20）

（本文編輯：嚴瑋雯）

325015 溫州醫科大學附屬第一醫院（新院區）病理科（黃卡特、陳霖、余霞、吳亮）；寧波市北侖區人民醫院病理科（肖維華）

肖維華，E-mail：hua2577@126.com