間質液壓與涎腺腺樣囊性癌惡性表型的關系及相關分子機制

[摘要] 目的 探討腺樣囊性癌（ACC）細胞受力后的基因表達及調控物質變化特點，從而闡明間質液壓促進ACC細胞惡性表型獲得的分子基礎及其作用的分子機制。方法 加壓（103.74 kPa）培養ACC2細胞，根據加壓時間不同將實驗組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。以未加壓培養的ACC2為陰性對照，未加壓培養的的ACCM為陽性對照。采用免疫組織化學法半定量檢測各組表皮生長因子受體（EGFR）的表達，逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測基質金屬蛋白酶（MMP）9和EGFR mRNA表達，Western blot法檢測MMP9、EGFR、磷酸化表皮生長因子受體（P-EGFR）、角質形成細胞生長因子（KGF）、磷酸化細胞外信號調節激酶（P-ERK）蛋白表達。結果 隨著加壓時間的延長，ACC2細胞內EGFR、P-EGFR、MMP-9、KGF、P-ERK的表達逐漸增加，整體呈時間正相關，且均高于陰性對照組。結論 在力學刺激下，ACC2細胞中黏附、轉移相關分子的mRNA及蛋白表達水平均升高。

[關鍵詞] 間質液壓； 腺樣囊性癌； 細胞培養； 壓力

[中圖分類號] R 739.87 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.02.018

[Abstract] Objective To explore the effects of stress imposed on adenoid cystic carcinoma （ACC）， therefore to clarify the molecular basis and mechanism of ACC’s malignant phenotype under the elevated tumor interstitial fluid pressure. Methods ACC cells were cultured under pressure （103.74 kPa）， and were divided into four groups （3 h group， 6 h group， 12 h group， 24 h group） according the pressure time. Untreated ACC2 was as negative control group， untreated ACCM was as positive control group. The level of epidermal growth factor receptor （EGFR） was detected by semiquantitative analysis of immunoche-mistry. Matrix metalloproteinase 9 （MMP9） and EGFR mRNA expression were assessed by reverse transcriptase polymerase chain reaction. EGFR， phosphorylation epidermal growth factor receptor （P-EGFR）， MMP9， keratinocyte growth factor （KGF） and phosphorylation extracellular signal-regulated kinase （P-ERK） protein expressions were assessed by Western blot. Results As the extension of pressure time， the expression of EGFR， P-EGFR， MMP9， KGF， P-ERK in ACC2 gradually increased， which were positive correlation with pressure time， and were higher than that of negative control group. Conclusion Under the stimulation of pressure， the mRNA and protein levels of adhesion molecules and metastatic relative molecules in ACC2 were sharply elevated.

[Key words] interstitial fluid pressure； adenoid cystic carcinoma； cell culture； pressure

涎腺腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是來自涎腺的上皮源性腫瘤，占涎腺惡性腫瘤的21.9%～24%。腺樣囊性癌具有特殊的生物學行為，極易復發和遠處轉移，早期侵犯神經，并沿神經播散，而經區域淋巴道轉移十分罕見[1]。ACC遠處轉移最常見的部位是肺、肝以及骨等。因此，ACC曾被描述為頭頸部最具破壞性和不可預見性的腫瘤之一。近年來，癌細胞惡性演進過程中的分子機制及影響因素成為研究重點。ACC高轉移株ACCM低表達細胞外基質相關分子（如Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白）及黏附相關分子（如鈣黏著蛋白）。同時，ACCM高表達調控細胞外基質降解基因和細胞生長黏附與周期相關基因，前者如基質金屬蛋白酶9（matrix me-talloproteinase 9，MMP9），后者如成纖維細胞生長因子7，即角質形成細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）[2]，其都與腫瘤的轉移相關。升高的腫瘤內間質液壓（interstitial fluid pressure，IFP）可以通過酸化周圍環境、降低氧氣含量、增加局部流體靜脈壓、調控基因表達等，促進腫瘤早期轉移并成為治療屏障[3-4]。研究表明，原發部位IFP升高可以促進腫瘤肺部及淋巴道轉移[5]。升高的IFP可以通過pH值降低、組織缺氧等因素改變細胞微環境從而促進ACC細胞增殖，增強細胞侵襲能力，為腺樣囊性癌的侵襲轉移提供條件，但是造成生物學改變的具體機制尚不清楚[6]。本實驗的目的是研究在增高的IFP作用下腺樣囊性癌細胞基因表達及調控物質變化的特點，闡明IFP對腺樣囊性癌侵襲能力增加的分子基礎及其作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

ACC高轉移株ACCM、低轉移株ACC2由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國），逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗體、山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶復合物及顯色劑DAB抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（Bioworld Technology公司，美國），磷酸化表皮生長因子受體（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化細胞外信號調節激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗體（Abcam公司，美國）。過氧化物酶標記的二抗及增強化學發光底物（Millipore公司，美國）。

1.2 細胞培養

ACC細胞培養：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，細胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化細胞。細胞生長至70%～80%用于后續實驗。

1.3 實驗分組

取對數期生長的ACC2接種于培養面積為25 cm2的細胞培養瓶中，設定壓力強度為103.74 kPa，根據加壓時間不同將實驗組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。另外將加壓培養的ACC2設置為陰性對照組，未加壓培養的ACCM設置為陽性對照組。

1.4 免疫組織化學法半定量檢測EGFR的表達

將密度為5×104個·mL-1的細胞懸液滴于爬片中央，待細胞貼壁后，在孔板內追加培養基，孵育過夜，于103.74 kPa加壓3、6、12、24 h后，棄去細胞培養基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的細胞爬片均按免疫ABC法進行檢測。3%過氧化氫液37 ℃孵育20 min阻斷內源性過氧化物酶；羊血清37 ℃封閉30 min；滴加EGFR抗體4 ℃過夜，次日37 ℃復溫1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根過氧化物酶復合物37 ℃ 30 min，DAB顯示1 min。設立空白對照：兔血清代替一抗；陰性對照：PBS代替一抗。顯微鏡下細胞膜及細胞漿內出現棕色顆粒即為EGFR表達陽性。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法檢測MMP9和EGFR mRNA的表達取各組細胞，以Trizol試劑盒方法提取總RNA，取等量RNA進行逆轉錄反應，合成cDNA，經Taq-DNA聚合酶作用擴增目標基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH為內參，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加壓組基因的表達量為基線，分析各處理組表達量的改變。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正義鏈），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反義鏈）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正義鏈），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反義鏈）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正義鏈），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反義鏈）。

1.6 Western blot法檢測相關蛋白表達

取對數期生長的細胞，以PBS清洗，加入細胞裂解混合液后，將細胞刮下，14 000 r·min-1離心15 min，取上清并行蛋白含量測定。加入等體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中加熱10 min。樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓100 V。電泳完成后濕轉或半干PVDF膜上，再將此膜于4 ℃封閉過夜。次日按Western blot試劑盒說明書，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK單抗進行抗原抗體結合反應和化學發光實驗。

2 結果

2.1 加壓環境對細胞內EGFR表達的影響

免疫組織化學檢測結果表明：陰性對照組ACC2低表達EGFR，隨著加壓時間延長，實驗組EGFR表達逐漸增加，整體呈時間正相關性，加壓12 h后達到最大，與陽性對照組ACCM的表達接近（圖1）。

Western blot檢測結果表明：1）與陰性對照組相比，實驗組EGFR的表達量在加壓3 h后達到峰值，超過了陽性對照組中EGFR蛋白表達量，但是其蛋白表達量并未隨著加壓時間延長而逐步增加，在加壓24 h后降至與陰性對照組相似水平。盡管EGFR的表達量未體現出明顯的時間相關性，但在加壓后，總蛋白的表達量仍有明顯的上調。2）實驗組P-EGFR的表達量呈時間正相關性，隨著加壓時間的延長，P-EGFR蛋白表達量逐漸增長，并在加壓24 h后達到峰值，而陽性對照組及陰性對照組中P-EGFR均為低表達（圖2）。

2.2 加壓環境對MMP9和EGFR mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表達量在加壓6 h開始上調，在加壓24 h達到最大，表達量整體表現出時間正相關性。MMP-9加壓24 h后其表達量是陰性對照組的3.8倍，EGFR加壓24 h其表達量是陰性對照組的4.5倍（圖3）。

2.3 壓力刺激對轉移黏附相關蛋白的影響

Western blot檢測結果表明：實驗組隨著加壓時間的延長，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表達量均逐漸增加。MMP9及P-ERK的表達量在加壓6 h后明顯增加，加壓24 h后略有降低；KGF的表達量與時間呈正相關，蛋白表達量在加壓24 h后達到最大。陰性對照組的MMP9、KGF、P-ERK均低表達。

3 討論

為了驗證腫瘤微環境能與各種基因相互作用，本研究采用免疫組織化學技術半定量檢測不同加壓時間對EGFR表達的影響，結果顯示ACC2細胞在間質液壓升高的情況下上調EGFR表達量。為了更準確地證明間質液壓的升高可以影響EGFR蛋白水平的表達，本研究還采用Western blot方法檢測了EGFR及P-EGFR的表達情況，結果也證實了腫瘤微環境中間質液壓與ACC2中蛋白表達改變的相關性。

MMP9與細胞侵襲遷移能力相關，且ACC細胞的侵襲性與加壓時間呈正相關性[7]。本實驗中檢測了MMP9的mRNA及蛋白表達量，RT-PCR結果顯示IFP的升高可從mRNA水平上調MMP9基因的表達，從而改變細胞的生物學行為，進一步證實了腫瘤微環境在腫瘤發生發展中的重要作用；然而蛋白水平的檢測結果卻是在加壓環境中MMP9的蛋白表達量并未隨時間延長而逐步增加，僅在加壓6 h及12 h后出現了表達高峰。筆者推測，在ACC中可能還存在其他的與侵襲轉移相關的分子。研究認為：P-ERK的上調與ACC肺轉移存在密切關系，KGF是與腺樣囊性癌密切相關的黏附相關分子，加之腫瘤微環境中IFP的升高也為腫瘤細胞轉移提供了有利環境[4，8-9]。在本實驗中筆者檢測了加壓環境中P-ERK及KGF在ACC中的表達情況。Western blot結果在一定程度上證實了這兩種蛋白的表達量隨著加壓時間的延長而逐步增加。這就為加壓環境中腺樣囊性癌侵襲轉移能力增加提供了分子基礎。同時蛋白水平的檢測也證實了EGFR及P-EGFR的表達量隨著環境的改變而改變。這一結果表明腫瘤微環境可與腫瘤細胞相互作用，改變細胞的生物學行為。隨著IFP的升高，細胞內與惡性表型相關的基因及蛋白表達量增加，為ACC2侵襲轉移提供了分子基礎。

IFP的升高與調控血管生成的基因相關，降低其表達或者改善間質流體動力學可早期降低IFP，從而利于常規放化療的進行[4]。血管內皮生長因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脫氫酶激酶1等基因產物可改變血管的滲透性，降低間質液壓，改善細胞外酸化和缺氧，從而克服腫瘤微環境成為治療屏障這一問題[10]。趨化因子受體CXCR4與腺樣囊性癌的組織學類型及轉移潛能呈正相關性。在高壓環境下黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Src的激活有利于直腸癌細胞的黏附。那么IFP的升高會影響ACC細胞的黏附能力嗎？能否解釋ACC的極易復發、早期轉移以及神經侵襲性的生物學行為呢？因此在今后的實驗中，將繼續檢測與血管相關的分子（如血小板-內皮細胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及Src等）在加壓環境中表達量是否改變，進一步建立體內模型；并且，利用VEGF抑制劑、CAⅨ以及丙酮酸脫氫酶激酶1的基因產物來改善腫瘤微環境中升高的間質液壓，觀察ACC的生物學行為以及上述指標的表達情況，為腫瘤治療提供理論依據。

綜上所述，本實驗表明，腫瘤微環境中間質液壓的升高可從mRNA及蛋白水平兩方面影響MMP9、KGF、P-ERK的表達，從而調控細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。

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（本文編輯 李彩）