甲狀旁腺激素與雌激素對去勢雌性大鼠牙槽骨代謝的影響

[摘要] 目的 觀察甲狀旁腺激素與雌激素單獨和聯合應用對去勢雌性大鼠牙槽骨代謝的影響。方法 選用4月齡雌性Wistar大鼠66只，分成兩組，分別為偽手術組（n=18）和去勢組（n=48）。8周后各處死8只證實骨質疏松造模成功。剩余的偽手術組（A組，n=10）Wistar大鼠作為對照；將剩余的去勢組Wistar大鼠隨機分成4組，分別為去勢組（B組）、去勢加雌激素組（C組）、去勢加甲狀旁腺激素組（D組）、去勢加雌激素和甲狀旁腺激素組（E組），每組10只。A組和B組注射生理鹽水（1 mL·kg-1）；C組注射苯甲酸雌二醇（10 μg·kg-1）； D組注射甲狀旁腺激素（20 μg·kg-1）；E組注射苯甲酸雌二醇（10 μg·kg-1）和甲狀旁腺激素（20 μg·kg-1）。隔日腹腔注射1次，用藥8周。治療后處死大鼠并測定牙槽骨骨密度，觀察每組大鼠骨組織形態計量學參數及血清鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）水平。結果 去勢手術8周后，去勢組大鼠牙槽骨密度明顯低于偽手術組（P<0.05）。用藥8周后，C、D、E組骨密度、骨小梁面積百分比（%Tb.Ar）、骨小梁寬度（Tb.Th）和骨小梁數量（Tb.N）較B組均有明顯提高，其中E組提高最明顯（P<0.05）。各組血清鈣磷值無明顯改變（P>0.05），B組ALP值較A組明顯升高（P<0.05）。結論 間歇性、小劑量注射甲狀旁腺激素能增加去勢大鼠牙槽骨的骨密度和改善骨結構，與雌激素聯合使用對骨質疏松的治療有協同作用。

[關鍵詞] 甲狀旁腺激素； 雌激素； 骨質疏松； 牙槽骨

[中圖分類號] Q 593+.6 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.02.007

[Abstract] Objective To investigate the influence of parathyroid hormone and estrogen on alveolar bone metabolism of castrated female rats. Methods Sixty-six female Wistar rats which were healthy and 4 months old were divided into two groups， with group SHAM （n=18） and group ovariectomy （OVX） （n=48）. After 8 weeks of ovariectomy， the osteoporosis model was confirmed by examing 8 ovariectomized and sham-operated rats. The rest 10 rats in group SHAM were the control group （group A）. The rest 40 rats in group OVX were divided into ovariectomized group （group B）， ovariectomized and treated with estrogen （group C）， ovariectomized and treated with parathyroid hormone （group D）， ovariectomized and treated with estrogen and parathyroid hormone （group E） at random with 10 in each group. Group A and B injected physiological saline（1 mL·kg-1）， group C injected estradiol benzoate （10 μg·kg-1）， group D injected parathyroid hormone （20 μg·kg-1）， group E injected parathyroid hormone （20 μg·kg-1） and estradiol benzoate （10 μg·kg-1）. The intraperitoneal injection were maken every other day to rats in each group， which continued for 8 weeks. The bone mineral density （BMD）， bone histomorphology and serum Ca， P， alkaline phosphatase （ALP） were measured after therapy. Results After 8 weeks of ovariectomy， the lumbar BMD of ovariectomized rats were significantly declined compared with those of the sham-operated rats （P<0.05）. Eight weeks later after the drug use， the BMD， %Tb.Ar， Tb.Th， Tb.N in group C， D， E were slightly elevated compared to group B， espe-cially the group E （P<0.05）. Serum calcium and phosphorus values did not change significantly （P>0.05）. ALP values in group B was significantly higher than that in group A （P<0.05）. Conclusion Intermittent application of parathyroid hormone in small doses can increase alveolar BMD of castration rats and improve their bone structure. And it can have synergy effects on the treatment of osteoporosis if it is used combining with estrogen.

[Key words] parathyroid hormone； estrogen； osteoporosis； alveolar bone

骨質疏松癥是老年人常見的一種骨代謝疾病，尤其是絕經后婦女發病率很高，給社會和家庭帶來了巨大的經濟負擔，成為不容忽視的一種全身代謝性疾病。研究[1-2]表明，骨質疏松癥對牙槽骨的骨礦含量和剩余牙槽骨體積都會產生明顯影響。這些影響是在臨床進行相關口腔疾病治療過程中所不能忽視的。目前臨床上對骨質疏松癥的治療，主要是通過抑制骨吸收和降低骨轉換率來提高骨密度，而對骨質量的改善尚缺乏有效的治療方法。近年來的研究[3-4]發現，小劑量、間歇應用甲狀旁腺激素對骨形成有促進作用，同時還可以改善骨骼的微結構，為原發性骨質疏松癥的治療開辟了更有效的新途徑。

本研究通過去除雌性Wistar大鼠雙側卵巢組織建立骨質疏松動物模型，觀察甲狀旁腺激素與雌激素對去勢后雌性大鼠牙槽骨的影響，從而為臨床上應用甲狀旁腺激素治療與絕經后女性骨質疏松相關的口腔疾病提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

甲狀旁腺激素（上海吉爾生化有限公司，批號：S110819-04，每支100 μg，純度97.3%），苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H31021114，每支2 g·L-1），大鼠甲狀旁腺激素酶聯免疫分析試劑盒（濟南格因生物科技公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、鈣試劑盒（Olympus Diagnostica GmbH公司，日本），EstradiolⅡ雌二醇診斷試劑盒（Roche Diagnostics GmbH公司，德國）。

1.2 主要儀器設備

雙能X線骨密度測量儀（XR-36型，Norland公司，美國），全自動生化分析儀（AU5400型，Olym-pus公司，日本），病理切片機、計算機病理圖像采集與分析系統（Leica公司，德國）。

1.3 實驗動物模型的建立

選用雌性Wistar大鼠66只（購自山東大學動物實驗中心），4月齡，體重220～260 g，SPF級。飼養7 d后進行手術，建立實驗模型。100 mg·kg-1氯胺酮腹腔注射麻醉，其中48只（去勢組）背部正中切口切除雙側卵巢，其余18只（偽手術組）僅切除卵巢周圍等量脂肪組織。所有大鼠同等條件下喂養，自由飲水攝食，喂食標準顆粒飼料。

1.4 動物分組和給藥方法

術后8周，偽手術組和去勢組各取8只實驗動物，放血處死后取上頜骨行骨密度測定，確認大鼠骨質疏松模型建立成功后進行實驗分組。除偽手術組10只（A組）外，去勢組再隨機分為去勢組（B組）、去勢加雌激素組（C組）、去勢加甲狀旁腺激素組（D組）、去勢加雌激素和甲狀旁腺激素組（E組），每組10只。A組和B組：按1 mL·kg-1體重腹腔注射0.9%生理鹽水；C組：按10 μg·kg-1體重腹腔注射苯甲酸雌二醇；D組：按20 μg·kg-1體重腹腔注射甲狀旁腺激素；E組：按10 μg·kg-1體重腹腔注射苯甲酸雌二醇和按20 μg·kg-1體重腹腔注射甲狀旁腺激素。隔日1次，用藥時間為8周。

1.5 觀察指標

各組大鼠用藥后8周抽取大鼠靜脈血，然后全部放血致死后取大鼠上頜骨標本。測定指標為：1）生化指標：將2 mL全血離心后制備血清，采用全自動生化分析儀進行血清鈣、磷、ALP濃度的生化分析。2）骨密度：采用雙能X線骨密度測量儀通過計算機系統應用軟件測量大鼠上頜骨標本骨密度，精確度CV=1%。3）骨形態計量學測定：將骨組織置于4%多聚甲醛內固定72 h，10%甲酸脫鈣，流水沖洗12 h，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，硬組織切片機沿骨長軸方向切成厚度為5 μm的切片，蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，將制作完成的切片運用Leica計算機病理圖像采集與分析系統及Image Pro Plus圖像分析軟件進行形態觀察和骨組織形態計量學測量。測量大鼠上頜牙槽骨的骨小梁面積百分數（%Tb.Ar）、骨小梁寬度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）和骨小梁間隔（Tb.Sp），每片測量3次取均值[5]。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件包對實驗數據進行分析，組間比較采用單因素方差分析，樣本間的兩兩比較采用多個樣本的q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠骨質疏松模型造模成功

大鼠去勢手術后8周，去勢組、偽手術組大鼠骨密度分別為（0.130±0.016）、（0.141±0.007） g·cm-2，去勢組大鼠的骨密度顯著低于偽手術組（P<0.05）。提示骨質疏松模型造模成功。

2.2 甲狀旁腺激素與雌激素對去勢雌性大鼠骨密度

的影響

實驗大鼠用藥8周后，通過雙能X線骨密度測量儀測量各組大鼠上頜牙槽骨的骨密度。通過對比發現C、D、E組大鼠牙槽骨密度均較B組有明顯增加（P<0.05）；E組大鼠和D組大鼠相比，牙槽骨密度增加（P<0.05）；C、D組之間牙槽骨密度差異無統計學意義（P>0.05）（圖1）。

2.3 甲狀旁腺激素與雌激素對去勢雌性大鼠骨組織

形態及形態計量學參數的影響

去勢手術8周后，進行組織病理學檢查。觀察大鼠上頜骨的組織切片可見，偽手術組大鼠骨小梁粗大、致密，排列規則；而去勢組大鼠骨小梁變得細小、稀疏，有斷裂，間隙增寬，排列變得十分紊亂、不規則（圖2）。用藥治療8周后發現，C組和D組骨小梁結構得到改善，而E組骨小梁結構改善更加明顯，與偽手術組相似（圖2）。

3 討論

甲狀旁腺激素是由甲狀旁腺細胞合成分泌的一種單鏈多肽分子，是調節細胞外鈣、磷濃度的主要激素之一，主要作用是使血鈣、血磷濃度維持在正常水平，靶器官主要是腎臟、骨骼和小腸[6]。近年來人們通過實驗發現小劑量間歇應用甲狀旁腺激素可以明顯增加松質骨、皮質骨骨量和提高骨生物力學強度，且經大規模臨床研究證實，經美國食品藥品管理局批準作為骨質疏松的治療藥物上市[7]，故與甲狀旁腺激素等新型促骨形成劑聯合應用以提高療效成為今后骨質疏松治療的發展方向。

本實驗說明甲狀旁腺激素的主要作用是促進骨轉換過程中的成骨細胞骨形成功能。成骨細胞骨形成功能提高，不僅可以明顯增加皮質骨的骨密度，而且可以改善骨結構，提高抗骨折能力，從而明顯減少骨折的風險。但是甲狀旁腺激素在臨床治療中也有一定的副作用，包括頭暈、惡心、背痛和下肢痙攣。還有動物實驗顯示出甲狀旁腺激素有增加骨肉瘤發病率的風險[8]。在今后的研究中應該開發甲狀旁腺激素的新劑型，改善其副作用，增強患者的依從性，或者研究現有藥物之間的相互作用，取長補短，使其能更好的應用于臨床治療。

雌激素是調節骨代謝的重要激素之一，它對骨骼的發育和骨量的維持有著必不可少的作用。當雌激素減少或者缺乏時，它可通過調控破骨細胞生成的細胞因子，使破骨細胞數量增加，或者抑制成熟破骨細胞凋亡而促進骨吸收[9]。本實驗中用藥8周后，C組骨密度明顯增加；大鼠骨小梁的結構得到明顯改善，%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N增加，Tb.Sp減少，證實了雌激素對去勢后大鼠骨組織有減少骨吸收，促進骨形成的作用。

本實驗通過建立去勢雌性大鼠模型，應用甲狀旁腺激素、雌激素及兩者聯合治療，結果顯示：C組和D組都表現為骨量增加，C組的骨形成參數和骨吸收參數均降低，D組的骨形成指標明顯升高，而骨吸收指標雖較A組高，但較B組有所降低。提示兩者在治療機制上的差別，雌激素主要通過抑制破骨細胞吸收和骨轉換，保持原有骨量。而甲狀旁腺激素則在提高骨轉換的同時，也提高了骨量和骨小梁的連接性，使骨的生物性能得到改善。甲狀旁腺激素在絕經后骨質疏松癥中所起的作用主要是通過成骨細胞分泌的骨吸收因子促進破骨細胞的生成來實現的。雌激素有拮抗甲狀旁腺激素的骨吸收作用，能夠刺激成骨細胞活性，因此去勢后的大鼠由于雌激素缺乏使骨組織對甲狀旁腺激素作用的敏感性增加，骨質吸收增加。E組與C組和D組比較，能較大地提高骨量，改善骨結構，說明兩者對骨量的形成有協同作用。在本實驗中E組在生化指標、骨密度和骨組織形態計量學指標等方面均較C和D組改善效果明顯，但其機制仍不清楚。

綜上所述，甲狀旁腺激素可明顯增加骨密度，改善骨結構，提高抗骨折能力，與雌激素聯合使用對骨質疏松的治療有協同作用，為今后臨床上應用甲狀旁腺激素治療與絕經后女性骨質疏松相關的口腔疾病提供了實驗基礎。

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（本文編輯 杜冰）