種植體周?chē)讓?duì)頜骨成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

[摘要] 目的 研究種植體周?chē)讞l件下炎性微環(huán)境對(duì)頜骨成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法 原代分離培養(yǎng)和純化種植體周?chē)讈?lái)源和正常組織來(lái)源的人頜骨成骨細(xì)胞，取第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖能力，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)基因骨鈣素（OCN）、Runx2、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)。結(jié)果 從培養(yǎng)第4天起，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞（P<0.05）。培養(yǎng)7 d時(shí)，與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞相比，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞相關(guān)基因OCN、Runx2、Col Ⅰ的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)也顯著降低（P<

0.05）。結(jié)論 種植體周?chē)椎难仔晕h(huán)境降低了頜骨成骨細(xì)胞的增殖及分化能力。

[關(guān)鍵詞] 種植體周?chē)祝?成骨細(xì)胞； 生物學(xué)功能

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 783.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.02.006

[Abstract] Objective To study the effect of peri-implantitis inflammatory microenvironment on the biological function of jaw bone osteoblasts. Methods Primary mandible osteoblasts from peri-implantitis and normal tissue were isolated and cultured. Third-generation purified osteoblasts were identified and detected. The proliferative activity of osteoblasts was evaluated through MTT assay. Osteocalcin （OCN）， Runx2， and collagen Ⅰ （Col Ⅰ） mRNA levels were examined by real-time quantitative poly-merase chain reaction. OCN protein levels were determined by Western blot. Results After 4 d of culture， the proliferative activity of osteoblasts from peri-implantitis became lower than that of normal tissue （P<0.05）. After 7 d of culture， OCN， Runx2， and Col Ⅰ mRNA expression decreased （P<0.05）. The OCN protein levels also decreased （P<0.05）. Conclusion Peri-implantitis inflammatory microenvironment can decrease the proliferation and differentiation activity of mandible osteoblasts.

[Key words] peri-implantitis； osteoblast； biological function

種植體周?chē)资菍?dǎo)致種植體松動(dòng)失敗的主要原因之一，可以使種植體周?chē)喂墙M織功能喪失。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，其生物學(xué)功能與種植體骨性結(jié)合緊密相關(guān)。種植體周?chē)浊捌谘芯恐饕性谘仔约?xì)胞因子和相關(guān)致病菌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，目前已經(jīng)證實(shí)種植體周?chē)l溝液中的炎性細(xì)胞因子和致病菌的獨(dú)立因子對(duì)鼠成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能有不同程度的影響[1-2]。

本研究從種植體周?chē)谆颊呙撀浞N植體周?chē)墙M織中獲取成骨細(xì)胞，通過(guò)對(duì)炎癥與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，探討種植體周?chē)讓?duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為種植修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本收集

種植體周?chē)椎墓墙M織樣本來(lái)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植體位于磨牙區(qū)且因種植體周?chē)壮霈F(xiàn)種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來(lái)源的樣本來(lái)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術(shù)患者，夾取舌側(cè)骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒(méi)有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質(zhì)疏松癥等全身系統(tǒng)性疾病。本研究已經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且每例患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化

PBS反復(fù)沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國(guó)）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國(guó)）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國(guó)），吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，待鋪皿80%進(jìn)行傳代。采用反復(fù)貼壁法[3]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。

1.3 堿性磷酸酶鑒定染色

將第3代分離純化后的成骨細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于24孔板，細(xì)胞達(dá)70%時(shí)，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復(fù)沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）染色1 h。PBS反復(fù)沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)觀察及照相。

1.4 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細(xì)胞混懸液，調(diào)整密度為2×104個(gè)·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%

CO2孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot法檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)

取第3代細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞用0.01 mol·L-1 PBS反復(fù)沖洗3遍，裂解細(xì)胞提取蛋白。取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過(guò)夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國(guó)）（1︰1 000稀釋?zhuān)┖挺?actin（1︰2 000稀釋?zhuān)?7 ℃孵育2 h，洗膜后，經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國(guó)）（1︰4 000稀釋?zhuān)┓跤?0 min，化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物，X線(xiàn)片顯影并定影，所有雜交信號(hào)經(jīng)成像分析儀系統(tǒng)測(cè)定條帶密度進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化

種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中狀態(tài)基本相同，10～14 d時(shí)從組織塊中爬出，形狀多為不規(guī)則形和三角形（圖1）。反復(fù)貼壁法純化成骨細(xì)胞貼壁后，2種來(lái)源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯差異，細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形和多邊形，胞核可見(jiàn)多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。

2.2 堿性磷酸酶鑒定染色

細(xì)胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來(lái)源細(xì)胞都表現(xiàn)出了堿性磷酸酶陽(yáng)性，但正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞比種植體周?chē)讈?lái)源成骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)更多染色顆粒。

2.3 2種來(lái)源的成骨細(xì)胞增殖能力的比較

MTT檢測(cè)結(jié)果（圖4）表明，正常組織來(lái)源與種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞都表現(xiàn)出了一定的體外擴(kuò)增能力，從第4天起2種來(lái)源細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞。

2.5 2種來(lái)源的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d時(shí)，與正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞相比，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)降低，相對(duì)灰度值分析表明種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)水平約為正常組織來(lái)源的1/3（P<0.05）（圖6）。

3 討論

骨結(jié)合是牙種植手術(shù)的基礎(chǔ)。種植體與頜骨骨性結(jié)合面的形成與種植區(qū)的骨密度密切相關(guān)，骨密度越高，種植體與骨的結(jié)合率就越高[4]。種植體周?chē)渍窃谘仔晕h(huán)境下，破壞了種植體與頜骨的骨結(jié)合，從而使種植體周?chē)喂墙M織的功能喪失。成骨細(xì)胞在骨組織的修復(fù)和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝的主要細(xì)胞；因此，研究炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞很有意義。

本研究從種植體周?chē)追N植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞，通過(guò)比較炎癥組織來(lái)源的成骨細(xì)胞和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞的增殖能力以及相關(guān)骨組織修復(fù)基因的表達(dá)等生物學(xué)功能變化，探討炎性微環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

本實(shí)驗(yàn)選用的成骨細(xì)胞均為第4代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，結(jié)果表明，炎癥組織來(lái)源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)后仍然具有一定的炎癥組織來(lái)源特異性。炎性細(xì)胞因子和種植體周?chē)字虏【亩玖σ蜃訒?huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖能力顯著下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)上并沒(méi)有表現(xiàn)出和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞有明顯差異，但是在細(xì)胞增殖活力方面表現(xiàn)出了不同，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的增殖活力整體低于正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞。筆者認(rèn)為這是由于種植體周?chē)椎难仔晕h(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。

Runx2和Col Ⅰ是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo)，Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨組織的形成與重建過(guò)程中具有重要的作用[5]。炎性因子會(huì)影響Runx2的表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細(xì)胞分化成骨的重要基質(zhì)。研究[8]表明，種植體周?chē)椎凝l溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞的Runx2和Col Ⅰ表達(dá)水平相比正常組織來(lái)源顯著下降，表明炎性微環(huán)境可影響成骨細(xì)胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達(dá)，這與Liu等[9]對(duì)干細(xì)胞的研究結(jié)果一致。

OCN與成骨細(xì)胞的礦化緊密相關(guān)，在一定程度上反應(yīng)了成骨細(xì)胞礦化的能力。學(xué)者[10]研究證實(shí)炎性微環(huán)境會(huì)降低OCN的表達(dá)。本研究中，種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN mRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致OCN蛋白水平也明顯降低。可見(jiàn)炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞礦化的能力。

炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受多方面調(diào)控，通過(guò)對(duì)比種植體周?chē)讈?lái)源的成骨細(xì)胞和正常組織來(lái)源的成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能變化，可以確定炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是種植體周?chē)墙M織吸收的重要原因。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。

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（本文編輯 李彩）