HPLC測定水產品中喹乙醇代謝物殘留量的方法探討

摘 要 建立了高效液相色譜儀檢測水產品中喹乙醇代謝物（3-甲基喹噁啉-2-羧酸，MQCA）的方法。樣品用乙酸乙酯提取、磷酸鹽緩沖液萃取、鹽酸酸化、乙酸乙酯反萃取，反相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，外標法定量。喹乙醇代謝物在0.005～1.0 mg/kg范圍內線性關系良好，相關系數為1.0000，檢出限為0.14 μg/kg，定量限為0.46 μg/kg。回收率在78.5%～85.7%，相對標準偏差在1.33%～2.34%。優化方法后，平均回收率提高24.9個百分點。

關鍵詞 高效液相色譜法；水產品；喹乙醇代謝物；優化方法

中圖分類號：S912；O657.7+2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2014）34-55-04

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20141224.1039.019.html 網絡出版時間：2014/12/24 10：16：00

喹乙醇（N-羥乙基-3-甲基-乙-喹啉-1，4-二氧化物）是一種化學合成抗菌促生長劑，用作飼料添加劑，對大多數動物有明顯的致畸[1]作用，對人也有致畸形、致突變、致癌的危害，《中國獸藥典》（2005版）有明確規定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產養殖。3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）為喹乙醇主要代謝物，是國家食品法典委員會認定的標示殘留物。

常用MQCA的檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）。雖然LC-MS/MS法提高了定性、定量的準確性和靈敏度，但儀器價格昂貴，檢測成本高，很多區縣質檢機構和小型檢測機構不具備條件，仍只好采用高效液相色譜法進行檢測。

本實驗參照農業部1077號公告-5-2008（水產品中喹乙醇代謝物殘留量的測定）[2-3]，在允許偏離的基礎上改進方法，提高回收率，為第三方檢測機構和其他實驗研究機構提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑

MQCA標準品（≥98.0%），德國Dr. Ehrenstorfer公司。

乙酯乙酯、甲醇為色譜純，美國霍尼韋爾；甲酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，成都科龍試劑。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽的配制：稱取12.0 g磷酸二氫鈉和14.2 g磷酸氫二鈉，加水溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調節pH至8.0，加水定容至1000 mL。

1.2儀器、設備

安捷倫高效液相色譜儀1200，配可變波長紫外檢測器；

分析天平：感量0.00001 g，賽多利斯BT25S；

天平：感量0.01 g，丹弗儀器TP-202；

高速冷凍離心機：美國THERMO Biofuge Stratos；

漩渦混合器、旋轉蒸發儀等。

1.3實驗方法

樣品制備：取新鮮的鰱魚肌肉，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，混勻后用小型絞肉機制樣。

提?。悍Q取5.00 g樣品于50 mL離心管子中，加20.0 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩5 min，8000 r/min離心8 min，上清液倒入150 mL分液漏斗中。再加20.0 mL乙酸乙酯重復提取1次，合并上清液于150 mL分液漏斗中。再加15.0 mL磷酸鹽緩沖液于離心管中，漩渦振蕩5 min，10000 r/min離心15 min，上清液倒入之前的150 mL分液漏斗中，振蕩分液漏斗1 min，靜置分層，下層收集到另一50 mL離心管子中。

凈化：向離心管中加260 μL濃鹽酸，振蕩充分混勻后，加15.0 mL乙酸乙酯，蓋上蓋子，振蕩提取10 min，10000 r/min離心15 min，上清液轉入150 mL平底燒瓶中。再加15 mL乙酸乙酯萃取1次，合并上清液到150 mL平底燒瓶中，濃縮后用甲醇—1%甲醇（V/V=45/55）定容至5 mL，過0.45 μm微孔濾頭，上機測定。

1.4上機條件

檢測波長：320 nm；

柱子：ZORBAX SB-C18 4.6×250 mm，5 μm；

柱溫箱：40℃；

流動相：甲醇、1%甲醇之比為45∶55，流速1 mL/min；

進樣量：50 μL；

保留時間：7.595 min。

2結果與分析

2.1MQCA標準品和樣品譜圖

譜圖見圖1（A、B、C）。

2.2樣品分析和回收率實驗

鰱魚空白樣品中未檢出喹乙醇代謝物（MQCA）。向鰱魚空白樣品添加 0.08 mg/kg，0.2 mg/kg，0.8 mg/kg三個水平，每個水平設6個平行，分別按優化方法和標準方法進行回收實驗?；厥章屎途芏纫姳?。

由表1可見，優化條件后平均回收率比標準方法提高24.9個百分點，精密度也提高了。

2.3喹乙醇代謝物（MQCA）的標準工作曲線

對0.005， 0.01， 0.05， 0.25， 0.5， 1.0 μg/mL系列標準工作液進行色譜分析，按其所得峰面積與對應標準溶液的濃度作標準曲線（圖2）。MQCA在0.005～1.0 mg/kg范圍內線性關系良好，線性方程為y=93.740x+0.0721， 相關系數為1.0000。

2.4檢出限和定量限

根據檢測限（LOD）測定信噪比應大于3，定量限（LOQ）測定信噪比大于10的原理，計算檢出限為0.14 μg/kg，定量限為0.46 μg/kg，比標準規定的方法檢測限（4 μg/kg）更低，能滿足國內水產品中MQCA的檢測要求。

2.5方法優化

本實驗在實施初期，按照農業部1077號公告-5-2008標準（水產品中喹乙醇代謝物殘留量的測定）的方法進行實驗，回收率較低。因此，在該標準基礎上進行了方法優化，優化條件見表2。

采用表2的優化主要是因為標準中勻漿的操作會損失部分肉質和藥物；增加乙酸乙酯和磷酸鹽緩沖液的用量是為了能更充分地提取MQCA；增加鹽酸的用量是將磷酸鹽緩沖液調節至酸性，促進酸化，MQCA充分被乙酸乙酯萃取；增大離心的轉速和時間是為了更好地除去雜質。從表1可知，改進方法后，平均回收率可提高24.9個百分點。

凈化操作中吸取離心后的上層乙酸乙酯時要盡量吸取，但不要將下面的水層吸到，否則在減壓濃縮時不能濃縮干，影響定容體積，還會在上機時明顯增高雜質峰峰高，加寬目標峰峰寬，且重復性較差。

3結論

本實驗對前人關于水產品中喹乙醇代謝物（MQCA）殘留量的檢測方法進行探討，在農業部1077號公告-5-2008標準基礎上改進，實驗中沒有采用蛋白酶酶解、固體萃取[4-9]等復雜、高成本的操作，而是采用萃取、離心等簡單的操作，具有回收率較高、成本低、操作簡便、適用性強等優點，可為第三方檢測機構和其他實驗研究機構檢測喹乙醇代謝物提供參考。

參考文獻

[1] 陳杖榴.獸醫藥理學[M].北京：中國農業出版社， 2002：240.

[2] 中華人民共和國農業部.農業部1077號公告-5-2008，水產品中喹乙醇代謝物殘留量的測定高效液相色譜法[S].北京：中國農業出版社，2008.

[3]國家質量監督檢驗檢疫局.GB/T 20797-2006 肉與肉制品中喹乙醇殘留量的測定[S].北京：中國標準出版社，2007.

[4] 吳玉杰，陳冬梅，陶燕飛，等.高效液相色譜法測定動物組織中3-甲基喹惡喹-2-羧酸殘留量[J].分析科學學報，2009，25（4）：427-430.

[5] 趙東豪，黎智廣，楊金蘭，等.高效液相色譜-串聯質譜測定水產品中殘留的喹乙醇代謝物[J].分析試驗室，2010，29（9）：19-22.

[6] 貝亦江，王揚，何豐，等.高效液相色譜法測定水產品中喹乙醇代謝物殘留量[J].食品科學，2013，34（1）：255-288.

[7] YAO Y S， SHEN J Z， WU C M.Determination of 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid in porcine liver by high performance liquid chromatography[J].Chinaahvm，2011，38（2）：187-190.

[8] Wu Y J，Yu H，Wang Y L，et al.Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline -2-carboxylic acid in animal tissues[J].Journal of Chromatography.A，2007，1146（1）：1-7.

[9] Huang L L，Xiao A G，Fan S X，et al.Development of liquid chromatographic methods for determination of quinocetone and its main metabolites in edible tissues of swine and chicken[J].Journal of AOAC International，2005，88（2）：472-478.

（責任編輯：丁志祥）