通用旋轉組合設計法優化白僵菌發酵培養基研究初報

摘 要 運用通用旋轉方法設計方案，以秸稈等添加料為培養基基質，以產孢量為指標，尋找成本低、效率高、實用性強的分生孢子粉生產配方。結果表明：（1）麥麩19.5 g，碎米23.0 g，秸稈粉29.5 g，豆粉15.0 g是白僵菌Bb-021發酵最適合培養基配比；（2）在25℃，濕度90%～100%條件下培養5 d產孢量達到9.24×1013個/mL孢子。

關鍵詞 白僵菌；發酵；培養基；通用旋轉

中圖分類號：S482.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2014）13-020-03

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20140704.2038.022.html 網絡出版時間：2014-7-4 20：38：00

白僵菌（Beauveria bassiana）屬于半知菌綱鏈孢霉目鏈孢霉科，是一種真菌性殺蟲劑，其孢子接觸害蟲后產生芽管，通過皮膚侵入其體內長成菌絲，并不斷繁殖使害蟲新陳代謝紊亂致死。白僵菌的致病力強，防治害蟲效果好，持效期較長，對高等動物和植物無害。白僵菌的使用有利于減少化學農藥的使用量，避免環境污染，使防治成本降低；容易獲得；對天敵無害，維護了生態平衡；防治的害蟲不易產生抗藥性[1-3]。

目前對白僵菌的發酵有液體發酵法，固體發酵法和液固雙相發酵法。液固兩相培養法由于生產效率高、經濟實用而被廣泛采用[4-5]。因此，本文選用液固雙相發酵二次通用旋轉組合設計實驗方案，控制配料的種類和添加數量，在保證白僵菌功能性質不受影響的前提下，建立了以產孢量為目標函數的函數模型，并研究固體培養基配料秸稈粉、麥麩、碎米、豆粉和水之間的關系，從中篩選出最佳的培養料配合比例，為優化發酵工藝和增加白僵菌產孢量提供一定的理論支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

白僵菌Bb-021，菌株為實驗室分離菌種。

1.1.2液相培養基

PDB培養液（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL）。

1.1.3固相培養基

4種載體，即麥麩、碎米、秸稈粉、豆粉。接種培養后，計算各組合的產孢量。

1.2方法

1.2.1通用旋轉組合設計

以影響白僵菌發酵的麥麩（X1）、碎米（X2）、秸稈粉（X3）、豆粉（X4）為 4個試驗因子，以白僵菌的產孢量（Y）為目標，4因素（1/2實施）的二次通用旋轉組合設計，共計20個試驗點，用以確定白僵菌發酵培養基最優工藝組合。確定零水平及變化區間如下：秸稈粉以30 g為零水平；麥麩、碎米以20 g為零水平；豆粉以15 g為零水平，共設置0、±1、±1.6818五種水平。

1.2.2發酵工藝

白僵菌孢子粉1.0 g→加0.05%Tween-80的無菌水20 mL→研磨器研磨至無菌塊→渦旋儀震蕩20 min→血球計數板計數（用0.05%Tween-80和白僵菌孢子粉將孢子懸液調節到1×108孢子/mL）→取1 mL菌懸液加入到含100 mLPDB發酵液的發酵瓶中→（25±1）℃恒溫搖床中振蕩培養3 d，振蕩頻率為200 r/min→在超凈臺中，用滅菌薄棉花過濾去除菌絲→取2 mL過濾菌液分別加入不同組合發酵瓶中，滅菌玻璃棒攪拌均勻→25℃恒溫培養箱培養→5 d后，超凈臺下攪拌均勻，每瓶各取1 g（濕重），0.05%Tween-80無菌水100 mL洗脫孢子→血球計數板法計數產孢量。

1.2.3產孢量的計算

用血球計數板依次對懸浮液中的白僵菌孢子進行計數，按對角線法取5個大格為1個計數單位，每個濃度的孢子懸浮液取5個計數單位的平均值。

1.2.4統計分析

采用DPS數據處理系統中二次通用旋轉組合設計試驗的統計方法。

2結果與分析

2.1白僵菌發酵最適培養基

利用二次通用旋轉組合設計方案，其實驗組合及結果見表1。按照20個試驗結果計算出所擬合的回歸方程的各項系數，并根據試驗結果進行方差分析（表1）可知，失擬性檢驗差異不顯著，可認為所選用的二次回歸模型是適當的；可以進一步分析，剔出α=0.10的不顯著項后，建立產孢率對試驗因子的回歸方程為：Y=25.00349+11.09911X2+8.67611X32-7.79250X1X2。生長量函數因不可能考慮到全部因素，因而求解不一定得到實際上最優化的條件。如果將該模型在電腦上擬合試驗，采用頻率次數分析法便可尋找最優工藝。對數學回歸模型進行頻率分析得到的結果見表2。通過表2可以看出，在95%的置信區間內產孢量大于3.743×1012的優化方案為麥麩19.03～20.41 g，碎米22.85～24.05 g，秸稈粉29.16～30.84 g，豆粉14.30～15.71 g。從處理中選出的優化培養方案的變量值不局限于旋轉設計里20個給定的因子水平之內，試驗優化方案的產孢量為9.24×1013個/mL（xi：-1.6820，1.6820，-1.6820，-1.6820），由此可知實際測定值與理論值比較接近。為便于實際生產，將優化方案定為麥麩19.5 g，碎米23.0 g，秸稈粉29.5 g，豆粉15.0 g。

2.2數學模型的應用分析

選取秸稈粉、豆粉2個因素固定于零水平，作圖分析麥麩、碎米2個因子間的互作效應（圖1）。從圖中可以看出在麥麩一定時，隨著碎米量的增加白僵菌的產孢量呈逐漸上升趨勢；當碎米含量較低時，隨著麥麩量的增加產孢量也有所增加；當碎米含量較高時，產孢量隨麥麩的增加反而減少。這可能是因為碎米少時麥麩提供主要營養，當碎米增加時，碎米取代麥麩提供主要營養，并且碎米間空隙較多使培養基通氣量增加，從而更加利于白僵菌的發酵。

由圖2可以看出碎米和秸稈粉的互作效應。在秸稈粉一定時，碎米與產孢量成正比；在碎米一定時，產孢量隨著秸稈粉的增加先降低后升高。這可能是由于秸稈粉大量時提供足夠的營養，少量時增加發酵罐疏松程度，從而獲得高產孢量。

3討論

本實驗采用二次通用旋轉組合設計進行試驗，降低成本，避免了資源消耗，提高了結果的精確度。在多因素的系統中，每個因素間都存在著互作、互制的復雜關系。任何一個因素的微小改變都可能給實驗帶來巨大的影響。在發酵實驗中就遇到過此類問題，為了減少試驗誤差，提高產孢量、減少成本及優質高產的目標，參考許多文章的基礎上，采用4個因素（麥麩、碎米、秸稈粉、豆粉）作為發酵培養基，通過二次通用旋轉組合設計，取得了一定的效果。本研究的試驗結果與單因素試驗所得到的結論略有差異，主要因為研究因素中有兩個因素對產孢量影響較為顯著，另外兩個不顯著，這還需進一步實驗研究。

參考文獻

[1]Dunn P H，Mechalas B J， Biological and integrated control of pest organisms in forestry[J].InvertebrPathol.1963，5（3）：451-455.

[2]李阜棣，胡正嘉.微生物學[M].北京：中國農業出版社，2000.283-284.

[3]蒲蟄龍.害蟲生物防治[M].北京：科學出版社，1977.104-108.

[4]Dorta B，Bosch A，Arcas J A，et al.High level of sporulation of Metarhizium anisopliae in a medium containing by 2 products[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1990，3（3）：712-715.

[5]Nelson T L，Low A，Glare T R.Large scale production of New Zealand strains of Beauveria and Metarhizium[A].In： Proceedings of 49th New Zealand Plant Protection Conference[C].1996，1：257-261.

（責任編輯：敬廷桃）