菟絲子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動學特征比較

王 莉， 張學蘭， 趙資堂， 李慧芬， 劉 洋

（山東中醫藥大學， 山東 濟南 250355）

菟絲子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動學特征比較

王 莉， 張學蘭*， 趙資堂， 李慧芬， 劉 洋

（山東中醫藥大學， 山東 濟南 250355）

目的 研究菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動學特征，比較炮制對其吸收代謝的影響。方法 大鼠分別灌胃給予生菟絲子和鹽菟絲子提取物， 于給藥前及給藥后不同時間點采集血樣， HPLC-UV法測定大鼠血漿中槲皮苷的質量濃度， 所得數據用 DAS2.1 軟件進行藥代動力學參數分析。 結果 血漿中槲皮苷在 0.148 ～29.6 μg/m L范圍內線性關系良好， 相關系數 r=0.997 0， 日內日間精密度均小于 10%， 相對回收率在 83.11% ～103.58%，準確度、精密度均符合生物樣品的測定要求。生菟絲子和鹽菟絲子提取物灌胃后血漿中槲皮苷的主要藥動學參數分別為 AUC(0-t)=(10.419 ±0.376) μg/mL· h， AUC(0-∞)=(10.745 ±0.393) μg/mL· h， Cmax=(5.398 ±0.202) μg/m L， t1/2=(1.157 ±0.156)h 和 AUC(0-t)=(16.485 ±0.351) μg/mL·h，AUC(0-∞)=(18.354 ±0.715) μg/mL· h，Cmax=(11.465 ±0.274) μg/mL， t1/2=(1.914 ±0.299)h。 結論 槲皮苷藥動學行為符合二房室模型， 鹽炙能促進槲皮苷在體內的吸收，并能延緩其體內消除過程，為闡明菟絲子鹽炙增效機理提供了科學依據。

菟絲子； 鹽炙； 槲皮苷； 血漿藥動學； HPLC-UV

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子 Cuscuta australis R. Br.或菟絲子 Cuscuta chinensis Lam.的 干 燥成熟種 子， 具有滋補肝腎、 固精縮尿、 安胎、 明目、 止瀉之功效［1］。 黃酮類化合物為菟絲子的主要活性成分，主要有金絲桃苷、槲皮苷、 槲皮素等［2］。 藥理研究表明， 菟絲子總黃酮具有促進成骨細胞活性［3］， 抗衰老［4］， 增強機體免疫［5］、 調節內分泌［6］及保護血管作用［7］。 其中槲皮苷具有抗氧化清除自由基［8］， 鎮靜催眠和抗抑郁［9-10］， 保護肝臟［11］， 抗動脈粥樣硬化12］等多種生物學活性。

菟絲子臨床主要以炮制品入藥，古代對菟絲子的炮制方法主要有炒制、鹽炙、制餅、酒炙、酒蒸等，現代主要有鹽炙、 炒黃等［13］。 《中國藥典》 2010 年版收載了生菟絲子和鹽菟絲子。菟絲子經鹽炙后可增強其補肝腎作用，但其鹽炙增效機理至今尚不明確。菟絲子鹽炙后金絲桃苷量降低， 而槲皮素量升 高［14］。 曾誠等［15］研 究 了菟絲子 灌 胃后大鼠血漿中槲皮素的藥動學規律。但炮制對菟絲子中槲皮苷的體內吸收代謝有何影響未見報道。本研究采用HPLC-UV法測定菟絲子生品與鹽炙品提取物大鼠給藥前及灌胃后不同時間點槲皮苷的血藥濃度，并計算有關動力學參數，比較菟絲子生品與鹽炙品在體內的吸收和代謝差異，為進一步闡明菟絲子的炮制原理及臨床合理用藥提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 儀器 日立 L-2000 型高效液相色譜儀 (日本日立)；FA1604N型電子天平 (精密度為十萬分之一， 上海精密科學儀器有限公司)； KQ-250E型醫用超聲波清洗器 ( 江蘇昆山市超聲儀器有限公司)； PM PLUS 型紅外測溫儀 (美國 Raytek 公司)； RE-52AA型旋轉蒸發器 ( 上海亞榮生化儀器廠)； H-1850D臺式高速冷凍離心機 ( 湘儀離心機儀器有限公司)； XK96-B快速混勻器 ( 姜堰市新康醫療器械有限公司)。

1.2 試劑和試藥 菟絲子購自亳州市成源中藥飲片有限公司，產地為山東省，經本校中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為旋花科植物 菟 絲 子 Cuscuta chinensis Lam.的 干燥成熟種子。 槲皮苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所， 批號為111538-200504， 供含量測定用)； 高效液相用甲醇 ( 色譜純)； 娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物 健康 SD大鼠， 雌雄不限， 體質量 (200 ±20) g， 由山東魯抗醫藥股份有限公司提供 ( 許可證號:scxk 魯20080002)。

2 方法與結果

2.1 菟絲子炮制品的制備 生菟絲子: 取原藥材， 揀去雜質和殘留的果梗。 鹽菟絲子: 取凈菟絲子 50 g， 加 10%食鹽水溶液 10 mL， 拌勻， 悶潤 1 h， 置熱鍋內， 180 ℃ (用紅外測溫儀測定鍋底溫度) 炒制 7m in， 取出， 放涼。 成品表面棕黃色， 微有裂口， 氣微香， 符合 《中國藥典》 2010年版鹽菟絲子的性狀要求。

2.2 灌胃藥液的配制 分別稱取菟絲子生品與鹽炙品各50 g， 分別加 10、 10、 10 倍量 80%乙醇超聲提取 3 次， 每次 1 h， 濾過， 合并濾液， 減壓濃縮至每 1 mL相當于 2.5 g生藥，置4℃冰箱保存，備用。

2.3 給藥和血樣采集 取健康 SD大鼠 12 只， 隨機分為 2組，即生菟絲子組和鹽菟絲子組，每組6只，給藥前禁食12 h， 自由飲水。 灌胃給予菟絲子生品和鹽炙品提取液(給藥劑量: 生品提取液相當于槲皮苷 32.13 mg/kg， 鹽炙品提取液相當于槲皮苷 33.39 mg/kg)。 分別于給藥前及給藥后 5、 15、 30、 60、 90、 120、 180、 240、 360 m in 經大鼠眼眶后靜脈叢取血， 每次 0.5mL， 置于 1mL肝素化的離心管中， 離心 10 min(4 000 r/min) ， 分離血漿， 置 -20 ℃冰箱保存，備用。

2.4 測定血漿中槲皮苷 HPLC-UV法的建立

2.4.1 色 譜 條 件［16］KromasiL C18色 譜 柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)； 流動相為 0.1% 磷酸水-甲醇 (60 ∶40)； 體積流量為 1.0 mL/min； 柱溫 30 ℃； 檢測波長 350 nm； 進樣量 20 μL。

2.4.2 對照品溶液的配制 精密稱取槲皮苷對照品 1.48 mg， 加甲醇溶解并稀釋至 10 mL量瓶中， 得到對照品原貯備液 148 μg/mL， 將該貯備液稀釋成 14.8 μg/mL的溶液，即得。

2.4.3 血漿樣品的前處理及分析 取給藥前及給藥后不同時間點的大鼠血漿各 200 μL， 加入甲醇 800 μL沉淀蛋白，渦旋混勻 3min， 12 000 r/min 離心 10min， 取上清液備用。精密吸取上述上清液各 20 μL， 注入液相色譜儀， 色譜圖見圖1。 結果空白血漿樣品在待測成分保留時間處無干擾峰，含藥血漿樣品各色譜峰分離良好。

2.4.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液 2、 10、 20、40、 100、 200、 400 μL， 置 10 mL具塞離心管中， 37 ℃空氣流吹干， 再分別精密加入空白血漿 200 μL， 配制成相當于槲 皮苷質 量濃度為 0.148、 0.74、 1.48、 2.96、 7.40、14.80、 29.60 μg/mL的血漿樣品。 按照 “2.4.3” 項下方法處理后進樣，分別記錄峰面積。以血藥質量濃度(μg/mL) 為橫坐標， 以峰面積為縱坐標， 用加權最小二乘法進行回歸計算，求得槲皮苷線性回歸方程 Y= 6 179.6X+62.041(r=0.997 0)， 線性范圍為0.148 ～29.6 μg/mL， 定量下限為 0.148 μg/mL。

圖1 空白血漿 （A）、 空白血漿加槲皮苷對照品 （B）、 含藥血漿 （C） HPLC圖

2.4.5 精密度試驗 精密吸取大鼠空白血漿 200 μL， 按“2.4.4” 項下的方法制備高、 中、 低 3 個質量濃度的血漿樣品 (29.6、 2.96、 0.148 μg/mL)， 每個質量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項下方法處理， 當天對樣品進行測定， 評價日內精密度。 重復測定3 d， 以當日的標準曲線標定血漿樣品的質量濃度，評價日間精密度，結果日內精密度 RSD分別為 4.9%、 2.2%、 1.9%， 日間精密度 RSD分別為 5.3%、 5.1%、 3.7%。

2.4.6 穩 定 性 試 驗 取 大 鼠 空 白 血 漿 200 μL， 按“2.4.4” 項下的方法制備高、 中、 低 3 個質量濃度點的血漿樣品 (29.6， 2.96， 0.148 μg/mL)， 每個質量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項下方法處理， 室溫下放置， 于制備后 0、 2、 4、 8、 10、 12 h 進樣測定， 計算 RSD值， 3個質量濃度的 RSD值分別為 3.60%、 2.04%、 2.43%， 表明標準血漿樣品室溫放置12 h穩定性良好。

2.4.7 回收率試驗 精密吸取大鼠空白血漿 200 μL， 按“2.4.4” 項下的方法制備高、 中、 低 3 個質量濃度的血漿樣品， 每個質量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項下方法處理，根據標準曲線計算槲皮苷量，測得值與理論值相比得相對回收率， 結果見表1。

2.5 菟絲子生、 制品中槲皮苷的藥代動力學參數計算及結果 將測得的血藥質量濃度數據運用 DAS 2.1 軟件按照非室模型進行擬合計算，結果表明，大鼠灌胃給予生、鹽菟絲子提取物后槲皮苷在大鼠體內的藥動過程符合二室模型；槲皮苷在大鼠體內的主要藥動學參數見表2， 其平均血藥質量濃度-時間曲線見圖 2。

3 小結與討論

3.1 通過 DAS 2.1 軟件房室模型分析， 生菟絲子、 鹽菟絲子提取物灌胃后大鼠血漿中槲皮苷的吸收代謝過程均符合二室模型。分析藥動學參數發現，大鼠灌服菟絲子生、制品提取物后， 槲皮苷藥時曲線下面積 AUC(0-t)、 AUC(0-∞)、達峰濃度 Cmax， 均為鹽炙品 ＞生品， 鹽炙品與生品比較，有顯著性差異，說明鹽炙能促進槲皮苷的吸收。消除半衰期 t1/2z: 鹽炙品 ＞生品， 鹽炙品與生品比較， 有顯著性差異，說明鹽炙能延緩槲皮苷在體內的消除。

表1 大鼠血漿中槲皮苷的相對回收率試驗結果

表2 菟絲子生品與鹽炙品灌胃后槲皮苷的藥代動力學參數比較 （ n=6， ˉ）

表2 菟絲子生品與鹽炙品灌胃后槲皮苷的藥代動力學參數比較 （ n=6， ˉ）

注: 鹽炙品與生品比較，*P＜0.01； 相對生物利用度 F= AUC(0-t)鹽· D生/AUC0-t)生· D鹽×100%=152.30%， D為 給 藥劑量

參數單位生菟絲子鹽菟絲子AUC(0-t)μg·mL-1·h10.419 ±0.37616.485 ±0.351*AUC(0-∞)μg·m L-1·h10.745 ±0.39318.354 ±0.715*AUMC(0-t)μg·m L-1·h218.108 ±0.76629.822 ±1.109 AUMC(0-∞)μg·m L-1·h220.618 ±1.18646.406 ±6.746 MRT(0-t)h1.738 ±0.0171.809 ±0.052 MRT(0-∞)h1.918 ±0.0652.521 ±0.283 VRT(0-t)h?21.564 ±0.0642.244 ±0.133 VRT(0-∞)h?22.653 ±0.4127.325 ±2.096 t1/2zh1.157 ±0.1561.914 ±0.299*Tmaxh0.50.5 Cmaxμg·mL-15.398 ±0.20211.465 ±0.274*

圖2 菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷平均藥時曲線比較 （ n=6， ˉ）

3.2 前期曾采用 HPLC法測定菟絲子生品與鹽炙品粉末(4 號 篩) 中槲皮 苷， 結 果 生 品 為 0.056%， 鹽 炙 品 為0.030%， 鹽炙后槲皮苷量降低 46.56%， 測定菟絲子生品與鹽炙品 80%乙醇提取物中槲皮苷提取量， 結果生品為0.040%， 鹽炙品為 0.042%， 說明鹽炙利于成分的煎出。本實驗在菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷量相近的情況下，比較菟絲子鹽炙品與生品中槲皮苷的生物利用度，結果鹽炙品約為生品的 1.5 倍， 說明鹽炙可提高菟絲子中槲皮苷的生物利用度，為菟絲子鹽炙增效提供了科學依據。

3.3 曾對菟絲子炮制品提取物中金絲桃苷進行測定， 由于金絲桃苷主要存在于菟絲子種仁里，提取物中金絲桃苷量很低， 在給藥劑量80 g/kg時， 大鼠血漿中仍未檢出金絲桃苷色譜峰，故未對其進行測定。

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R969.1

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10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.044

2013-02-18

國家科技重大專項-“重大新藥創制” -“山東省重大新藥創制中心建設” (2009ZX09301-013)

王 莉 (1987—) ， 女， 碩士生， 主要從事中藥炮制與中藥新藥研發。 Tel:15064148485， E-mail:wangliwl1987@126.com

*通信作者: 張學蘭 (1963—) ， 女， 教授， 碩士， 主要從事中藥炮制與中藥新藥研發。 Tel:13406062766， E-mail:zhang8832440@sina.com

日期:2013-10-23

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20131023.2049.006.html