烏蕨對樂果急性中毒的解毒活性研究

盧海嘯， 李家洲， 鄭玉華， 倪 林

（廣西玉林師范學院， 廣西 玉林 537000）

烏蕨對樂果急性中毒的解毒活性研究

盧海嘯， 李家洲， 鄭玉華， 倪 林

（廣西玉林師范學院， 廣西 玉林 537000）

目的 研究烏蕨對解救樂果急性中毒的活性部位。方法 采用樂果中毒小鼠模型，觀察烏蕨不同提取物對樂果急性中毒的解救效果，測定烏蕨對中毒小鼠的乙酰膽堿酯酶活性的影響和存活率。結果 烏蕨水提部位組能提高小鼠的存活率； 并能顯著提高乙酰膽堿酯酶的活力 (P＜0.01)。 結論 烏蕨水提部位能改善小鼠的中毒癥狀， 提高小鼠的存活率和乙酰膽堿酯酶的活力。

烏蕨；解毒；活性部位

烏蕨 為 鱗 始 蕨 科 Lindsaeaceae烏 蕨 屬 Stenoloma 植 物，又名大葉金花草［1-2］。 烏蕨在民間有 “ 萬能解毒藥” 之稱，廣泛用于解食物和農藥中毒，還用于治瘡毒、毒蛇咬傷等［3-4］。 研究表明， 烏蕨水 提 物的 70%乙醇 溶 解 物可使砷中毒的小鼠死亡 率顯著降低， 并能提高其 耐受性［5］。 此外，烏蕨還能防治四氯化碳肝損傷作用，并能降低血清中ALT、 MDA水平， 升高 SOD酶活性和抗氧化能力［6-8］。 據報道， 烏蕨湯能很好的治療慢性腎衰， 療效確切［9］。 林向東［10］用單味草藥烏蕨治療下肢頑固性潰瘍 50 余例， 均取得良好療效。關于烏蕨解救有機磷農藥中毒的活性部位的研究，目前尚未有報道。本實驗探討其醇提物解救有機磷農藥中毒的活性部位及其對乙酰膽堿酯酶活力的影響，為篩選新的有機磷農藥解毒劑提供一定的藥效學依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 昆明種小鼠， 雌雄各半， 體質量 (20 ± 4)g， 購于廣西醫科大學實驗動物中心， 清潔級， 許可證號:SCXK桂 2009-0002。

1.2 藥物及試劑 烏蕨采于廣西欽州市浦北縣白石水鎮陳依村，經廣西中醫學院劉壽養教授鑒定為陵始蕨科植物烏蕨 Stenoloma chusanum(Linn.)Ching in Sinensia。 采 后 粉碎， 60℃烘干備用； 樂果乳液 (廣東汕頭市西隴化工廠)、阿托品溶液 (山東新華制藥股份有限公司)、 碘解磷定溶液 (哈爾濱宏達動物藥品廠)、 氯化乙酰膽堿 (北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。 所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 HH-s數顯恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市醫療儀器廠)； U1901 紫外-可見分光光度計 (北京譜析科學儀器有限公司)； RE-2000 旋轉蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠)； SHZ-D(Ⅲ) 循環水式真空泵 ( 鞏儀市予華儀器有限責任公司)； 電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統有限公司)等。

2 方法

2.1 烏蕨提取物的制備 稱取 300 g烏蕨干草， 加入6 000 mL 65%乙醇， 加熱回流1 h， 用四層紗布過濾， 得到提取液。重復提取4次，合并提取液，減壓回收溶劑，得膏狀提取物，即粗提物。將所得粗提物分散于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、水部分。再將各部分分別減壓回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位。

2.2 實驗動物分組 將 100 只小鼠進行乙酰膽堿酯酶活性測定，計算每只小鼠的乙酰膽堿酯酶活力，剔除差異較大的， 選取60只按乙酰膽堿酯酶活力分層， 再按隨機數字表分為6組 (空白對照組、 模型組、 陽性對照組、 石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 水部位組)， 每組 10 只。 實驗前，將所有實驗用的小白鼠在實驗室內飼養1周，使其熟悉實驗環境，自由飲水和取食。

2.3 烏蕨不同提取部位對樂果中毒小鼠的活性篩選 實驗組 (模型組、 陽性對照組、 石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 水部位組) 通過灌胃給予樂果溶液 (45 mg/kg)， 空白對照組灌胃等體積的生理鹽水。

上述操作結束后立即給藥解救，烏蕨石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、 水部位組 (給藥量均為 100 mg/kg)， 陽性對照組每只小鼠立即靜脈注射按 1 mg/kg的阿托品溶液和按 75 mg/kg的碘解磷定溶液， 30 min 后， 進行尾靜脈取血，備用。最后記錄小鼠的死亡率。

2.4 烏蕨水提物對樂果中毒小鼠的影響 將 100 只小鼠進行乙酰膽堿酯酶活性測定，計算每只小鼠的乙酰膽堿酯酶活力， 剔除差異較大的， 選取60只按乙酰膽堿酯酶活力分層， 再按隨機數字表分為6組 (空白對照組、 模型組、 陽性對照組、 水部位低劑量組 (100 mg/kg)、 水部位中劑量組 (150 mg/kg)、 水部位高劑量組 (300 mg/kg)， 每組 10只。 按表3～4分組和灌胃給藥， 其中空白對照組灌胃等量的生理鹽水， 按 “2.3” 項的方法進行實驗， 記錄小鼠的死亡率。

2.5 乙酰膽堿酯酶活力的測定 采用乙酰膽堿酯酶試劑盒進行測定。

按下式計算酶活性的絕對值:

式中:Xs——水解乙酰膽堿的活力； A——樣品管的吸光度值； B——對照管的吸光度值； C——標準管的吸光度值。2.6 數據處理與統計分析 數據用 (-) 表示， 采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析， 實驗結果采用單因素方差分析法進行分析， 組間比較用 t檢驗。

3 結果與分析

3.1 小鼠的死亡率 結果如表 1、 表 2 所示， 陽性對照組和水部位組的小鼠死亡率與模型組比差別很明顯。水部位的高劑量組的死亡率最低，水部位組的死亡率與陽性對照組相當。說明烏蕨的水部位具有明顯的解毒作用。該部位應為烏蕨的抗樂果中毒的活性部位。且水部位組的死亡率隨劑量的增大而降低。

表1 小鼠的死亡率

表2 水部位不同劑量小鼠的死亡率

3.2 試驗前后小鼠血液膽堿酯酶活力的變化 結果如表3、 4所示， 給藥后各組的酶活力與空白對照組相比有不同程度的提高 (P＜0.05)， 陽性對照組、 烏蕨水部位組與模型組比有統計學意義 (P＜0.01)。 故烏蕨的解毒活性部位應該為烏蕨水部位。

烏蕨水部位的不同劑量組的酶活力與陽性對照組、模型組、 空白對照組相比均有統計學意義 (P＜0.01)， 且隨著劑量的增大呈現出一定的線性關系。烏蕨水部位低劑量組與陽性對照組相比無統計學意義，提示其藥效強度與陽性對照組相近 (P＞0.05)。 而中高劑量組的藥效強于陽性對照組 (P＜0.01)。

表3 烏蕨不同提取部位對小鼠血液膽堿酯酶活力的影響（s， n=10）

表3 烏蕨不同提取部位對小鼠血液膽堿酯酶活力的影響（s， n=10）

注: 與空 白對照組相 比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 與陽性對對照組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與水部位組比，○P＜0.05，○○P＜0.01

組 別藥物劑量/(mg·kg-1)給藥前給藥后空白對照組—13.59±0.2813.86±0.29●●▲▲○○模型組4513.37±1.8012.54±0.35**▲▲○○陽性對照組1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05±0.8915.43±0.19●●**石油醚部位組10014.21±0.8713.65±0.39**▲▲○○乙酸乙酯部位組10013.67±0.8112.84±0.41*▲▲○○水部位組10014.09±0.4915.27±0.36**●●

表 4 烏蕨水部位對小鼠血液膽堿酯酶活力的影響 （ˉ，n=10）

表 4 烏蕨水部位對小鼠血液膽堿酯酶活力的影響 （ˉ，n=10）

注: 與空白 對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模 型組比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 與 陽 性 對 照 組 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別藥物劑量/(mg·kg-1)給藥前給藥后空白對照組—13.59±0.2813.87 ±0.31●●▲▲模型組45.013.37 ±1.8012.57 ±0.39**▲▲陽性對照組1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05 ±0.8915.48 ±0.21**●●水部位低劑量組10014.09 ±0.4915.40 ±0.30**●●水部位中劑量組15013.40 ±1.4515.81 ±0.35**●●▲水部位高劑量組30014.09±0.7615.97 ±0.56**●●▲▲

4 討論

樂果為有機磷酸酯類農藥，是難逆膽堿酯酶抑制劑。目前，有機磷酸酯類農藥中毒主要是采用膽堿酯酶復活藥和阿托品解救。但膽堿酯酶復活藥使酶復活的效果因不同的有機磷酸酯類而異，一般來說，它對內吸磷、馬拉硫磷、對硫磷中毒的療效好，對敵百蟲、敵敵畏中毒有一定的療效，而對樂果中毒幾乎無效。原因是樂果中毒所形成的磷酰化膽堿酯酶比較穩定，幾乎是不可逆的，加以樂果乳劑含有苯，可能同時有苯中毒。本實驗結果表明，烏蕨水部位可明顯降低樂果致小鼠急性中毒的死亡率，提高血液膽堿酯酶的活力。 烏蕨水部位的低劑量 (100 mg/kg) 的藥效強度與陽性對照組相當， 而中劑量 (150 mg/kg)、 高劑量(300mg/kg) 的藥效強于陽性對照組。 其可能的解毒機理如下:①烏蕨水部位和樂果迅速結合，從而影響樂果的吸收，阻止樂果與乙酰膽堿酯酶的結合，防止樂果在體內形成毒性更強的氧化樂果，加速樂果在體內的消除。②烏蕨水部位和苯結合，阻止苯的吸收并加速苯在體內的消除。國內外學者對烏蕨的化學成分的研究表明，烏蕨主要含有黃酮類、 有機酸等化學成分［11-15］， 黃酮類化 合物具有明確的抗氧化能力，而烏蕨的解毒作用是否與其有關，尚不得而知。至于烏蕨水部位具體的解毒活性成分及具體的解毒機制，本課題組正在進行相關的研究中。

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R285.5

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:1001-1528(2014)02-0390-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.040

2013-02-23

玉林師范學院重點科研項目 (2011YJZD18)

盧海嘯 (1974—)， 男， 講師， 博士， 主要從事中藥與天然藥物活性成分及藥效篩選的研究工作。 Tel:15907758504， E-mail:luhaixiao76@163.com