黃藥子體外抗胃癌活性成分的篩選及分析

李春峰， 邱軍強(qiáng)， 苗晶囡， 張 翀， 張 寧， 劉樹民*

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科， 黑龍江 哈爾濱 150000； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

黃藥子體外抗胃癌活性成分的篩選及分析

李春峰1，2， 邱軍強(qiáng)2， 苗晶囡2， 張 翀2， 張 寧2， 劉樹民2*

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科， 黑龍江 哈爾濱 150000； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

目的 通過 MTT體外實(shí)驗(yàn)觀察黃藥子 4 種不同提取物及從石油醚提取物中分離得到的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇作用于 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 3 種人胃癌細(xì)胞株， 探討黃藥子不同提取物及兩個(gè)單體對3 種胃癌細(xì)胞株的增殖情況的影響， 從而篩選出黃藥子有效抗胃癌活性成分。 方法 采用 MTT法檢測 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12 mg/mL的不同質(zhì)量濃度的黃藥子石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物、 水層萃取物、 醇提物和最終質(zhì)量濃度為 1 ×10-4、 5 × 10-4、 1 ×10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇分別作用于 MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 細(xì)胞株 24 h 后對細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 石油醚萃取物、 醇提物、 黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇均有不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，而乙酸乙酯萃取物和水萃取物低劑量有不同程度的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用； 大劑量表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。 結(jié)論 從石油醚提取物中分離得到的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇對胃癌細(xì)胞均有抑制作用。

黃藥子； 黃獨(dú)乙素； β-扶桑甾醇； 癌； MGC803； BGC823； SGC7901

黃藥 子 為 薯 蕷 科 植 物黃 獨(dú) Dioscorea bulbifera L.的 塊莖，又名黃藥根、鐵秤砣等。藥性寒味苦，有毒，歸肺、肝經(jīng)。具有化痰散結(jié)、消癭止瘤、清熱解毒、涼血止血、抗癌的功效，其藥用價(jià)值較高，歷代本草對其治療癭疾、血證、 外科諸證的良效均有詳盡記載［1-6］。 近些年黃藥子的抗腫瘤功效逐 漸被大 家重視， 其對 S180( 小 白 鼠 肉瘤)、U14( 宮頸癌) 、 H22( 小鼠肝 癌) 等 均有抑制作 用［7-9］。 黃藥子的化學(xué)成分研究表明，其干燥莖塊中含有多種糖類、甾體皂苷和皂苷元、黃獨(dú)素等，從黃藥子中提取的不同成分按一定方式重組后抗癌療效高于傳統(tǒng)的酒泡［10-15］。 其中黃藥子 A， B， C以及薯蕷皂苷等均具有抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)采用 MTT法觀察黃藥子 4種不同提取物對 3種胃癌細(xì)胞株增殖抑制情況，分析不同提取物化學(xué)成分對于胃癌細(xì)胞的影響。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)石油醚提取物對腫瘤細(xì)胞的增殖有較好的抑制作用，將從石油醚提取物中分離得到的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇分別采用 MTT法觀察二者對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和細(xì)胞株 黃藥子為市售中藥飲片， 購自哈藥集團(tuán)世一堂飲片廠。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院付克教授鑒定， 所購中藥飲片為薯蕷科植物黃獨(dú) Dioscorea bulbifera L.的塊根。 實(shí)驗(yàn)用胃癌細(xì)胞株 MGC 803、 BGC823 和SGC 7901 由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈， 在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院細(xì)胞室傳代備用。

1.1.2 試劑 四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)(Sigma公司產(chǎn)品)， RPMI1640 培養(yǎng)基、 胰蛋白酶、 胎牛血清、 青霉素-鏈霉素溶液 (賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品)。

1.1.3 黃藥子石油醚、 乙酸乙酯、 水和乙醇提取物的制備

準(zhǔn)確稱取黃藥子飲片 1 kg， 粉碎過 60 目篩， 將藥粉用95%乙醇回流提取得總浸膏 112.7 g， 并作為乙醇提取物，出膏率為 11.3%。 乙醇提取物經(jīng)石油醚萃取 4 次合并萃取液濃縮干燥得到略帶清香味的暗黃色固體， 得率 0.34%，稱石油醚提取物。石油醚萃取后分別用乙酸乙酯、水按極性依次萃取得各提取物， 得率分別為 1.31%、 2.64%。 黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇為石油醚提取物分離得到， 實(shí)驗(yàn)時(shí)將各提取物及單體用優(yōu)級純 DMSO和無菌水 (20 ∶80) 配成所需質(zhì)量濃度后備用。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī) ( 科大創(chuàng)新股份有限公司) ， MP-501A超級 恒溫箱， MK-3 型酶標(biāo)儀、 超低溫冰箱 (賽默飛世爾儀器有限公司)， HZQ-C型空氣浴振蕩器、 DL-CJ-WD型醫(yī)用型潔凈工作臺 ( 哈市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)， HF-90 型二氧化碳培養(yǎng)箱 (力康發(fā)展有限公司) ， CKX-41-SF型倒置顯微鏡 ( 美國 philippines公司)， 超純水機(jī) (密理博上海貿(mào)易有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

MTT法測定 3 種細(xì)胞生長抑制率［16-19］選擇對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為 1 ×105個(gè)/L接種于 96 孔板，每孔 100 μL， 每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè) 6 孔重復(fù)， 邊緣空白孔加100 μL PBS 保持濕度， 設(shè)定空白對照只加培養(yǎng)基和溶劑，對照組加細(xì)胞培養(yǎng)基并給予溶劑。實(shí)驗(yàn)組分別給予各提取物終質(zhì)量濃度為 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10 和 12 mg/mL的不同提取物和最終計(jì)數(shù)分別為 1 ×10-4、 5 ×10-4、 1 × 10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇， 培養(yǎng) 24 h 后， 每孔分別加入 10 μL MTT 37 ℃ 孵育 4 h， 吸取上清， 加入 100 μL DMSO在平板搖床微振蕩 20 min 后， 用酶標(biāo)儀在波長 570 nm處 檢 測 每孔吸光 度 (A)， 計(jì)算 細(xì) 胞 生長抑制率(%)=1-(A實(shí)驗(yàn)-A本底)/(A對照-A本底) ×100%。

3 結(jié)果及分析

3.1 提取物對 3 種胃癌細(xì)胞株的生長抑制情況 將接種于96 孔板的胃癌細(xì)胞株 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 正常培養(yǎng) 24 h 后， 加入不同提取物繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 觀察細(xì)胞的存活率， 發(fā)現(xiàn) 0.5 mg/mL石油醚提取物作用于細(xì)胞株 BGC823和 SGC 7901 的抑制率分別是42.1%和60.2%， 而2mg/mL的石油醚提取物作用 于細(xì)胞 株 MGC803 的抑制 率約為61%， 與對照組比均有顯著性差異 (P＜0.05)， 見圖 1。

圖1 石油醚提取物對3種胃癌細(xì)胞的抑制作用 （n=3， ˉ）

0.5 mg/m L乙醇提取物作用于胃癌細(xì)胞株 MGC 803 抑制率 48.0%， 與對照組比有極顯著性差異； 作用于細(xì)胞株SGC 7901 抑制率為 49.0%， 與對照組比有顯著差異 (P＜0.01)， 見圖 2。

乙酸乙酯提取物作用于細(xì)胞株 MGC803 細(xì)胞在低劑量表現(xiàn)為促生長作用， 質(zhì)量濃度為 1 mg/mL時(shí)有促生長作用， 促生長率為 29.6%， 且與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)； 水提取物作用于細(xì)胞株 MGC 803 質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)促生長率為 43.9%， 與對照組相比有顯著性差異 (P＜0.05)； 6mg/mL的乙酸乙酯提取物作用于細(xì)胞株SGC 7901 表現(xiàn)為抑制生長， 抑制率為 13.6%且有顯著性差異 (P＜0.05)， 見圖 3。

圖2 乙醇提取物對 3種胃癌細(xì)胞的抑制作用 （n=3， ˉ）

圖3 乙酸乙酯提取物對 3種胃癌細(xì)胞的抑制作用 （ n=3， ˉ）

4 mg/mL水提取物作用于細(xì)胞株 SGC 7901 表現(xiàn)為抑制生長， 抑制率達(dá) 15.9%， 與對照組相比有顯著 性差異(P＜0.01)， 見圖 4。

圖4 水提取物對3種胃癌細(xì)胞的抑制作用 （ n=3， ˉ）

3.2 黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇對 3 種胃癌細(xì)胞株增殖的抑制作用 加入黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇繼續(xù)培養(yǎng) 24 h， 發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的黃獨(dú)乙素對胃癌細(xì)胞株胃癌細(xì)胞株 BGC823和 SGC7901 的抑制率較低， 且隨質(zhì)量濃度加大抑制率變化不大， 而對胃癌細(xì)胞株 MGC803 的抑制作用較強(qiáng)， 且隨質(zhì)量濃度變化抑制率逐漸增強(qiáng)， 見圖 5； β-扶桑甾醇對于胃癌細(xì)胞株 BGC823 和 SGC7901 在 1 ×10-4mg/mL抑制作用顯著， 與對照組相比差異顯著； 對胃癌細(xì)胞株 MGC803 的增殖抑制作用較小，見圖6。

圖5 黃獨(dú)乙素對3種胃癌細(xì)胞株增殖的影響

圖 6 β-扶桑甾醇對 3 種胃癌細(xì)胞株增殖的影響

4 討論

隨著現(xiàn)代社會腫瘤患者的增多，西藥毒副作用大，同時(shí)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在國際上的認(rèn)可度的提高，從天然藥用植物中發(fā)現(xiàn)新的抗癌的藥物的興趣正逐步顯示出來，開發(fā)抗腫瘤效果好且毒副作用低的傳統(tǒng)中藥亟需解決。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng) MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 3 種胃癌細(xì)胞株，研究黃藥子不同提取物的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)石油醚提取物和乙醇提取物抑制腫瘤生長的效果最好，且與劑量呈一定的線性關(guān)系， 與文獻(xiàn)［20］報(bào)道一致， 同時(shí)也驗(yàn)證了黃藥子作為傳統(tǒng)中藥對胃癌有顯著療效。同時(shí)發(fā)現(xiàn)從石油醚提取物中分離得到的黃獨(dú)乙素和 β-扶桑甾醇對胃癌細(xì)胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，同時(shí)首次在黃藥子中分離得到的甾醇類 β-扶桑甾醇的抗癌作用顯著， 二萜內(nèi)酯類黃獨(dú)乙素的抗癌作用較弱。石油醚提取物發(fā)揮抗腫瘤藥理作用可能是其含有的薯蕷皂苷元和二萜內(nèi)酯類成分發(fā)揮作用［21-27］， 為黃藥子抗腫瘤作用提 供了一定的依據(jù)。 為下一步開展黃藥子活性成分抗腫瘤作用機(jī)制的研究探討提供基礎(chǔ)。

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R285.5

:B

:1001-1528(2014)02-0387-04

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10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.039

2013-03-12

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目 (2011-145)； 國家自然基金面上項(xiàng)目 (30572368)

李春峰 (1978—) ， 男， 主任醫(yī)師， 研究方向: 胃癌腹腔轉(zhuǎn)移機(jī)制及中藥治療。 Tel:18745787187， E-mail:lichunfeng007@ 163.com

*通信作者: 劉樹民 (1963—) ， 男， 副教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥學(xué)中藥藥理。 Tel:(0451)87266988， E-mail:keji-liu@ 163.com