腦絡(luò)欣通膠囊的質(zhì)量控制研究

丁領(lǐng)振， 胡容峰，3，4*， 王 鍵， 楊 靜

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)， 安徽 合肥 230038；2.省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3.安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 安徽 合肥 230038； 4.安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230038）

［質(zhì) 量］

腦絡(luò)欣通膠囊的質(zhì)量控制研究

丁領(lǐng)振1，2， 胡容峰1，2，3，4*， 王 鍵1，2， 楊 靜1，2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)， 安徽 合肥 230038；2.省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3.安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 安徽 合肥 230038； 4.安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230038）

目的 建立腦絡(luò)欣通膠囊的質(zhì)量控制方法。 方法 采用 TLC法對(duì)制劑中主要藥材當(dāng)歸、 紅花進(jìn)行定性鑒別； 采用 HPLC法對(duì)黃芪中的黃芪甲苷， 三七中的三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1進(jìn)行定量測(cè)定。 結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰， 在與對(duì)照品或?qū)φ账幉南鄳?yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)， 陰性對(duì)照無(wú)干擾； 黃芪甲苷在 4.0 ～20.0 μg呈良好的線性關(guān)系， r=0.999 2； 三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1分別在 0.4 ～2.0 、 0.08 ～8.0、 0.08 ～8.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， r分別為 0.993 0、 0.992 0、 0.998 7。 結(jié)論 所建立的方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、 專屬性強(qiáng)、 重現(xiàn)性好，能夠更有效地控制該制劑的質(zhì)量。

腦絡(luò)欣通膠囊；黃芪甲苷；三七總皂苷；質(zhì)量控制

腦絡(luò)欣通膠囊由黃芪、當(dāng)歸、三七、紅花等七味中藥組成，為新安醫(yī)家王樂(lè)匋先生的臨床驗(yàn)方，具有益氣活血、 熄風(fēng)通絡(luò) 的功效［1-2］， 臨床 上用于治療缺血性中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥諸證，療效確切。為了保證該制劑的臨床療效，有效地控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用 TLC法對(duì)方中主要藥材當(dāng)歸、 紅花進(jìn)行定性鑒別，采用 HPLC法對(duì)黃芪甲苷、 三七皂苷R1、 人參皂苷 Rg1及人參皂苷 Rb1進(jìn)行定量測(cè)定，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供完整的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 硅膠 G薄層板 (青島海洋化工廠)；硅膠 H薄層板 (青島海洋化工廠)； ZF-2 型三用紫外分析儀 (上海安亭電子儀器廠)； 微量點(diǎn)樣器； LC-20AB 高 效 液 相 色 譜 儀 ( 日 本 島 津 )；SEDEX75 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (SEDERE)；C18色譜柱 (Global，250 mm×4.6 mm， 5 μm)； KQ2200型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；AP-01P真空泵 (Auto Science) 。

1.2 試 藥 黃 芪 甲 苷 對(duì) 照 品 ( 批 號(hào) 110781-200613)、三 七 皂 苷 R1對(duì) 照 品 ( 批 號(hào) 110745-200617)、 人 參 皂 苷 Rb1對(duì) 照 品 ( 批 號(hào) 110704-200921)、 人參皂 苷 Rg1對(duì) 照 品 ( 批 號(hào) 110703-200726)、當(dāng)歸對(duì)照藥材 (批號(hào) 120918-201014)、紅花對(duì)照藥材 (批號(hào) 120907-201111)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所； 腦絡(luò)欣通膠囊 (規(guī)格 0.5 g/粒， 批號(hào)為 111021、 111022、 111023) 及陰性樣品均自制；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 當(dāng)歸的 TLC鑒別［3］取本品 1 g研細(xì)， 加乙醚 20 m L， 超聲處理 10 min， 濾過(guò)， 濾液蒸干后殘?jiān)右掖? mL使其溶解，作為供試品溶液；取當(dāng)歸對(duì)照藥材 0.5 g， 同法制成對(duì)照藥材溶液； 再按處方比例稱取當(dāng)歸以外的藥材，按制劑工藝制備缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照膠囊，取該膠囊內(nèi)容物按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法( 《中國(guó)藥典》 2010 年版一部附錄 VIB) 試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各 10 μL， 分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上， 以正己烷-乙酸乙酯 (4 ∶1) 為展開(kāi)劑，展開(kāi)， 取出，晾干， 置紫外光燈 (365 nm) 下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.2 紅花的 TLC鑒別 取本品 1 g， 加 80% 丙酮溶液 5 mL， 密塞振搖 15 min， 靜置， 取上清液作為供試品溶液； 取紅花對(duì)照藥材 0.5 g， 同法制備對(duì)照藥材溶液；再按處方比例稱取紅花以外的藥材，按制劑工藝制備缺紅花的陰性對(duì)照膠囊，取該膠囊內(nèi)容物按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液［4］。 吸取上述溶液各 5 μL， 分別點(diǎn)于同一硅膠 H薄層板上， 以正丁醇-甲醇-水 (6 ∶1 ∶5) 為展開(kāi)劑，展開(kāi)， 取出，晾干， 置紫外燈 (365 nm)下檢視［5］。 結(jié)果， 供試品色譜中， 在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯橙黃色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖1 當(dāng)歸薄層色譜Fig.1 TLC chromatogram of Angelicae sinensis Radix

圖2 紅花薄層色譜Fig.2 TLC chromatogram of Carthami Flos

3 樣品中各成分測(cè)定

3.1 黃芪甲苷的測(cè)定

3.1.1 色譜條件［3］C18-ODS 色譜柱 (4.6 mm× 150 mm， 5 μm)； 流動(dòng)相為乙腈-水 (35 ∶65)； 體積流量 1.0 mL/min； 蒸 發(fā) 光 散 射 (ELSD) 檢 測(cè)器， 漂移管溫度 80 ℃； 氮?dú)怏w積流量 1.6 L/min。在以上色譜條件下，雜質(zhì)對(duì)黃芪甲苷測(cè)定無(wú)干擾，保留時(shí)間為 16 min 左右。 見(jiàn)圖 3。

圖 3 黃芪 HPLC-ELSD圖Fig.3 HPLC-ELSD chromatogram s of Astragali Radix

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品適量， 加甲醇配成 1 mg/mL的 溶液， 搖勻，0.45 μm濾過(guò)， 即得對(duì)照品貯備液。 精密吸取上述貯備液 4、8、 12、16、 20 μL依次注入液相色譜儀， 以峰面積的對(duì)數(shù) (Y) 為縱坐標(biāo)， 黃芪甲苷進(jìn)樣量的對(duì)數(shù) (X) 為橫坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程 Y=1.295 1X+3.325 3(r=0.999 2)。 結(jié)果表明， 黃芪甲苷在 4.0 ～20.0 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.1.3 供試液的制備 取本品 5 g， 加甲醇 30 m L， 加熱回流1 h， 濾過(guò)， 濾液蒸干， 殘?jiān)眠m量水溶解后用飽和的正丁醇振搖提取 3次， 每次 20 mL， 合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌 3 次， 每次 15 m L， 取正丁醇液蒸干， 殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至 25 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 搖勻， 0.45 μm濾過(guò)，即得。

3.1.4 精密度試驗(yàn) 分別吸取低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果 RSD分別為 1.13%、 1.89%、 2.05%。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述供試液 20 μL，分別于 0、 4、8、 12 h 進(jìn)樣， 結(jié)果 RSD為 1.32%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的樣品 5份， 按 “3.1.3” 項(xiàng)制備供試液， 依上述色譜條件測(cè)定， 結(jié)果 RSD為 1.74%， 表明本方法重復(fù)性良好。

3.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的樣品(批號(hào) 111022) 粉末 9 份， 每份約 2.5 g， 精密稱定，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液 (含黃芪甲苷 1 mg/mL)5.2、 6.5、7.8 mL，按 “3.1.3”項(xiàng)制備加樣回收率供試液，分別取20 μL按 “3.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。根據(jù)加入量和測(cè)得量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

3.2 三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1的測(cè)定

3.2.1 色譜條件［6］C18-ODS 色譜柱 (4.6 mm× 150 mm， 5 μm)； 流動(dòng)相為乙腈 (A)-水 (B) 梯度洗脫， 0 ～12 min(19%A)， 12 ～60 min(19%→36%A)； 體積流量 1.0 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm； 柱溫 30 ℃。 此條件下 HPLC色譜見(jiàn)圖 4。

3.2.2 溶液的制備 精密稱取適量的三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1及人參皂苷 Rb1對(duì)照品， 加入甲醇制成每 1 mL含三七皂苷 R10.1 mg、 人參皂苷 Rg10.4 mg、 人參皂苷 Rb10.4 mg的混合溶液，0.45 μm濾過(guò)， 作為對(duì)照品貯備液。 取本品內(nèi)容物5 g， 精密稱定， 加入甲醇 50mL， 稱定質(zhì)量， 放置過(guò)夜， 置80 ℃水浴上保持微沸2 h， 放冷， 再稱定質(zhì)量，補(bǔ)加甲醇至原質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液置蒸發(fā)皿中蒸發(fā)干， 殘?jiān)铀?5 mL使溶解， 加水飽和的正丁醇液振搖提取 3 次， 每次 20 mL， 將正丁醇液合并， 用氨試液30 mL洗滌， 棄去水液， 正丁醇液蒸干， 殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試液［7］。 按處方比例稱取三七以外藥材， 按制劑工藝制備缺三七的陰性對(duì)照膠囊，取該膠囊內(nèi)容物按供試液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

A.對(duì)照品 B.供試品 C.陰性對(duì)照1.三七皂苷 R12.人參皂苷 Rg13.人參皂苷 Rb1A.reference substances B.sample C.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma1.notoginsenoside R12.ginsenosides Rg13.ginsenoside Rb1

3.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取 “3.2.2” 項(xiàng)制備的對(duì)照品溶液 0.2、 4、8、12、16、 20 μL按上述色譜條件注入高效液相色譜儀，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量 X進(jìn)行線性回歸， 分別得三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1的回歸方程、 相關(guān)系數(shù)與線性范圍， 見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系結(jié)果Tab.2 Linearity of each component

3.2.4 精密度試驗(yàn) 分別吸取低、 中、 高 3 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以三七皂苷R1、 人參皂苷 Rg1及人參皂苷 Rb1的峰面積計(jì)算，RSD分 別 為 2.19%、 2.04%、 1.56%； 1.88%、1.16%、 1.22%；1.72%、 2.01%、1.75%。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “3.2.2” 項(xiàng)供試液置于室溫下， 放置不同時(shí)間后， 測(cè)定三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1及人參皂苷 Rb1的量。 結(jié)果表明， 樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào) 111021 樣品 5 份， 按“3.2.2”項(xiàng)制備供試液，精密吸取 20 μL進(jìn)樣，測(cè)定三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1及人參皂苷 Rb1的 RSD分別為 1.82%、 1.14%、0.95%， 結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

3.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定 9 份已知含有量的樣品 (批號(hào) 111022)， 每份約 0.5 g， 精密稱定，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品貯備液 (含三七皂苷 R10.720 1mg/mL、 人參皂苷 Rg11.431 5 mg/mL、 人 參 皂 苷 Rb11.022 7 mg/mL)0.64、 0.8、 0.96 mL， 按 “3.2.2” 項(xiàng)方法制備加樣回收供試液， 分別取20 μL進(jìn)樣， 記錄峰面積。根據(jù)加入量和測(cè)得量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表 3。 三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1的平均回收率分別為 99.5%、 98.8% 和99.2%， RSD分別為 1.17%、1.60%和 1.30%。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests

3.3 樣 品 測(cè) 定 取 3 批 腦 絡(luò) 欣 通 膠 囊， 按“3.1.3” 及 “3.2.2” 項(xiàng)分別制備樣品溶液， 分別按 “3.1.1” 及 “3.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定每粒膠囊中黃芪甲苷以及三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1， 結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 腦絡(luò)欣通膠囊中4種成分Tab.4 Concen tration of four constituents in Naoluo Xintong Capsules

4 討論

腦絡(luò)欣通膠囊中黃芪能補(bǔ)脾肺之氣，以益生血之源，為方中君藥。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其主要成分黃芪甲苷的量進(jìn)行監(jiān)控，以更好地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。在203 nm處檢測(cè)復(fù)方中指標(biāo)性成分黃芪甲苷， 存在雜質(zhì)干擾大、信噪比低、溶劑背景吸收難以消除等問(wèn)題［8］。因此， 本實(shí)驗(yàn) 采用 HPLC-ELSD法測(cè)定。在供試品溶液的制備中， 文獻(xiàn) ［9-10］ 用 D101 大孔樹(shù)脂進(jìn)行了純化，本實(shí)驗(yàn)未作此處理也能達(dá)到較好的基線分離，省去純化的繁瑣操作。

在對(duì)復(fù)方中的臣藥當(dāng)歸進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，為了減少?gòu)?fù)方中其他成分的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用乙醚為提取溶媒超聲 10 min， 以正己烷-乙酸乙酯 (4 ∶1)為展開(kāi)劑，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離度較好［11］。

三七為制劑中的貴重藥，雖然用量較少，但對(duì)制劑質(zhì)量影響較大。文獻(xiàn)報(bào)道，三七的主要有效部位是三 七 總 皂苷［12］， 本 實(shí) 驗(yàn) 對(duì)制 劑 中 三七 皂 苷R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1進(jìn)行定量測(cè)定，所建立的梯度洗脫方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠。在此條件下，樣品能夠達(dá)到較好的基線分離，并且大大縮短了分析時(shí)間。

［1］ 王 鍵，劉 昕.腦絡(luò)欣通對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠熱休克蛋白及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)， 2004， 2(4):271-272.

［ 2 ］ 王 鍵， 陳業(yè)農(nóng)， 唐 巍， 等.腦絡(luò)欣通對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞及相關(guān)調(diào)節(jié)因子影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志， 2008， 14(11):837-839.

［ 3 ］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:124， 141.

［ 4 ］ 王忠偉.頸康顆粒的薄層色譜鑒別［ J］.中國(guó)藥業(yè)， 2010，19(2):40.

［5］ 周海燕，常新全，趙潤(rùn)懷，等.七厘膠囊中紅花和兒茶的薄層色譜鑒別［ J］ .中國(guó)現(xiàn)代中藥， 2009， 11(2):32-33.

［ 6 ］ 曾榮華， 鄧雪媚， 盧慧嫻， 等.HPLC測(cè)定復(fù)方丹參片中三七總皂苷的含量［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南， 2010， 8(6): 21-23.

［7］ 梁旭明，鐘國(guó)躍， 張小梅，等.芪黃膠囊質(zhì)量控制研究［J］.中藥新藥與臨床藥理， 2011， 22(3):331-334.

［ 8 ］ 王 辰， 侯連兵， 劉 嬋.HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪注射液中黃芪甲苷的含量［J］.中藥材， 2006， 29(6):618-619.

［ 9 ］ 吳永平， 徐永梅， 曹 園， 等.HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪提取物中黃芪甲苷的含量 ［ J］.中成藥， 2001， 23(9): 673-674.

［10］ 徐忠坤， 徐海娟， 宋 娟， 等.HPLC法測(cè)定芪葛顆粒中黃芪甲苷［J］.中草藥， 2011， 42(1):94.

［11］ 張艷明， 王蘭霞， 李士博， 等.天芪氣血口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2010， 6(10):30-33.

［12］ 時(shí)圣明， 袁永兵， 陳常青， 等.HPLC法在三七及其制劑現(xiàn)代藥學(xué) 研究中的應(yīng) 用［ J］.藥 物評(píng)價(jià) 研究， 2010， 33 (6):472-475.

Quality control of Naoluo Xintong Capsules

DING Ling-zhen1，2， HU Rong-feng1，2，3，4*， WANG Jian1，2， YANG Jing1，2
(1.Anhui University of ChineseMedicine， Hefei230038， China； 2.Key Laboratory of Xin'an Medical， Ministry of Education， Hefei 230038， China；3.Anhui“115” Xinan Pharmaceutical R&D Innovation Team， Hefei230038， China； 4 .Key Laboratory of AnhuiProvincial TCM Research and Development， Hefei230038， China)

AIM To establish quality controlmethod of Naoluo Xintong Capsules.METHODS The chief components of the preparation， Angelicae sinensis Radix， Carthami Flos， were identified by TLC.The contents of astragaloside IV in Astragali Radix and notoginsenoside R1， ginsenosides Rg1and ginsenoside Rb1in Notoginseng Rodix et Rhizoma were determined by HPLC.RESULTS The spots in TLC were clear without interference.The linear range for astragaloside IV was4.0 ～20.0 μg(r=0.999 2).The linear range for notoginsenoside R1， ginsenosides Rg1and ginsenoside Rb1were 0.4 ～2.0 μg， 0.08 ～8.0 μg， 0.08 ～8.0 μg， respectively.CONCLUSION Themethod is simple， accurate， with high reproducibility， which can be used for the quality control of Naoluo Xintong Capsules.

Naoluo Xintong Capsules； astragaloside IV； Panax notoginseng saponins； quality control

R927.2

:A

:1001-1528(2014)02-0296-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.017

2013-04-10

國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (2012BAI26B03)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81274100)； 安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目 ( 皖人社秘 2011-38 號(hào)-26) ； 安徽省高層次人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資金 (2009Z061)

丁領(lǐng)振 (1987—) ， 男， 碩士生， 從事新制劑的研究。 Tel:18297928010， E-mail:375121300@qq.com

*通信作者: 胡容峰， 女， 博士， 教授， 從事藥劑學(xué)等課程的教學(xué)以及藥物新劑型與新制劑的研究。 Tel:(0551)5169149， E-mail: hurongfeng@163.com