廣西莪術水提物對大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶和微粒體藥物代謝酶的影響

楊秀芬， 石衛州， 程允相， 樊星花

（1.廣西中醫藥大學藥學院藥理學教研室， 廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，廣西 南寧 530023）

［藥 理］

廣西莪術水提物對大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶和微粒體藥物代謝酶的影響

楊秀芬1， 石衛州2， 程允相1， 樊星花1

（1.廣西中醫藥大學藥學院藥理學教研室， 廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，廣西 南寧 530023）

目的 研究廣西莪術水提物對大鼠肝臟胞漿液和微粒體內抗氧化酶和藥物代謝酶的影響。方法 用差速離心法制備肝臟胞漿液及微粒體， 測定抗氧化酶和藥物代謝酶 NADPH-細胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1 和谷胱甘肽-S-轉移酶 (GST) 和葡萄糖醛酸-轉移酶 (UGT) 的活性。 結果 在肝胞漿液， 與空白組比較， 廣西莪術各劑量組對超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽還原酶 (GR) 水平的影響沒有明顯差異 (P＞0.05)； 中劑量顯著增高過氧化氫酶 (CAT) 活性 (P＜0.01)； 高劑量明顯增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)。 廣西莪術各劑量組對 CYP2E1 和 UGT的活性均沒有顯著的影響 (P＞0.05)； 均明顯增高 GST活性 (P＜0.05)； 低劑量顯著降低 NADPH-細胞色素 P-450 還原酶活性 (P＜0.05)， 各劑量組明顯降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥鈉組明顯增高 CYP3A、 GST和 UGT的活性(P＜0.05)。 結論 廣西莪術可能會影響體內藥物代謝， 合并用藥時， 應考慮潛在的藥物間相互作用。

廣西莪術；抗氧化酶；藥物代謝酶

莪術為姜科植物蓬莪術 Cureuma phaeocaulis Val.、 廣西莪術 Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或 者 溫 郁 金 Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C.Ling的干燥塊莖［1］。 性辛、苦、溫，歸肝脾經，具有破血行氣止痛，積散結，破血祛瘀，行氣止痛等功效。近年來研究發現，莪術具有抗腫瘤、 抗病毒、 抗炎鎮痛、 抗白血病等作用［1］。 廣西莪術為廣西產大宗道地中藥材，約占莪術市場的60%的份額。本課題主要研究廣西莪術對大鼠肝臟抗氧化酶和藥物代謝酶的影響，以進一步探討廣西莪術的作用和作用機制，從而指導臨床合理用藥。

1 驗材料和方法

1.1 藥品和試劑 廣西莪術 rhizomes of Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang于 2011 年 4月26日購于廣西欽州市靈山縣陸屋鎮， 經廣西中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室何報作教授鑒定為正品。 藥物煎煮方法參見文獻 ［2］。

谷 胱 甘 肽-過 氧 化 物 酶 (GSH-Px 批 號20110628)、 過氧化氫酶 (CAT批號 20110609)、超氧化物歧化酶 (SOD批號 20110622)、 谷胱甘肽-S-轉移酶 (GST批號 20110707) 谷胱甘肽還原酶 (GR批號 20110701) 試劑盒均購自南京建成生物 工 程 研 究 所。 氨 基 比 林 (Sigma-aldrich，1001024266)； Tris( 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷，Sigma，Cat.No.T8060)； NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸， Scientific Research special， 004669)； G-6-P(葡萄糖-6-磷酸， Sigma， G7250)； NADP+-G-6-P(Sigma， Cat.No.D8090)；G-6-PDH( 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，Roche， G8020)； Triton X-100( 聚乙二醇辛基苯基 醚， Solarbio， Cat.No.T8200)；維生素 C(Sigma)； UDP-葡萄糖醛酸 ( 尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，Sigma)； 其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器 臺式低速離心機 (北京京立離心機有限公司)； TU-1901 紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責任公司)； 數顯恒溫水浴鍋 HH-8(國華電器有限公司， 型號 HH-2)； 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； 酶標儀 (德國 BioTeK公 司)； 96 孔板 (JET BIOFIL)； 冰 箱(SIEM ENS 公司， 型號 KK24T18TI)； 微量加樣器(法國 GILSON)； 超低溫冰箱 ( 美國 Thermo Forma，型號725)。

1.3 給藥方 法［3-5］雄 性 SD大鼠 40 只，體 質 量180 ～220g， SPF級， 合格證號:SCXK2009-0002，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。按體質量給藥，灌胃給予廣西莪術水煎液低、中、高生藥給藥量均為 0.81、 2.43、 7.29 g/kg， 1 日 1 次，連續 3周， 飼養至第21日， 以等量純凈水為陰性對照組: 1 日 1 次灌胃， 連續 21 d， 飼養至第 21 日。 陽性對照: 飼養方法同陰性對照組，飼養至第 18日，腹腔注射 80mg/kg的苯巴比妥鈉， 1 日1 次， 連續4 d。 給藥結束后， 大鼠禁食 12 h 后， 斷頭處死大鼠，分離肝臟，用冰冷的生理鹽水充分灌流、洗凈至白陶土樣，勻漿，4 ℃， 1 000 g， 離心 15 min，取上清液， 于 4 ℃， 12 500 g， 離心兩次，每次15min， 取上 清 液 轉 移 至 超 速 離 心 管 內， 4 ℃，105 000 g， 離心 1 h， 上清液為胞漿液， 沉淀為微粒體。

1.4 胞漿液抗氧化酶和微粒體 GST活性按試劑盒操作說明進行。

1.5 NADPH-細 胞 色 素 C （ P-450 ） 還 原 酶 的 測定［3］取 2.8 mL磷酸緩沖液，加微粒體蛋白懸液0.1 mL， 加細胞色素 C 0.1 mL，混勻，550 nm處測定吸光度值。測定管中操作步驟同上后，加入NADPH溶液 20 μL， 立即混勻， 秒表計時， 每分鐘測定 1 次 OD值， 連續測定 3 min。

1.6 氨基比林-N-脫甲基酶 （CYP3A） 活 性的測定［3-4］配制 0.5 mmol/L甲醛工作液， 取 0、 0.1、0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 m L工作液， 分別用蒸餾水補充到 1mL。 37 ℃水浴3min， 加入三氯醋酸終止反應，離心 10 min，取上清液 1 mL， 加入Nash 試劑 1 mL， 60 ℃水浴 10 min， 自來水冷卻，測定 420 nm處的 OD值。 以系列濃度的甲醛為橫坐標，各濃度標準液的OD值為縱坐標進行線性回歸，求得甲醛線性回歸方程。在測定管中加入微粒體蛋白懸液 0.5 mL， 氨基比林-MgCl2水溶液 0.5 m L， 37 ℃水浴溫孵 2 min 后， 加入 NADPH啟動反應， 37 ℃水浴 30 min，加入 ZnSO40.35 mL， 冰浴5 min，加 飽 和 Ba(OH)20.35 mL， 混 勻，放 置5 min后離心， 取上清液 1 m L， 其余步驟同甲醛標準曲線制備，依據甲醛標準曲線計算酶活性。

1.7 苯胺-4-羥化酶 （CYP2E1 ） 活性的測定［3-4］配制 10 μmol/L 4-氨基酚工作液， 取此工作液 0、0.2、 0.4、 0.6、 0.8 和 1.0 mL， 用 6%三氯醋酸(TCA) 補充至 1 m L， 加至已盛有 1%苯酚的試管中， 混勻，加入 1 mL 1 mol/L Na2CO3， 室溫放置30 min，測定 630 nm波長處吸光度值。以 4-氨基酚濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，進行線性回歸， 求得 4-氨基酚的線性回歸方程。 取 0.73 mL NADP+-G-6P Tris緩沖 液 與 0.03 mL鹽酸 苯 胺 混合， 37 ℃水浴 2 min， 加微粒體 0.2 mL，37 ℃水浴 30 min， 加入冰冷的 20%三氯醋酸 1 mL終止反應， 離心 15 min， 取上清液 1 mL， 其余步驟同 4-氨基酚標準曲線的制備， 依據 4-氨基酚標準曲線計算酶活性。

1.8 葡萄糖醛酸-轉移酶 （UGT） 活性的測定［3］

取輔助因子溶液 1 mL和 0.5 m L(1 mmol/L)2-氨基酚， 加 0.5 mL微粒體蛋白懸液啟動反應， 空白管加入 0.5 mL蒸餾水代替 2-氨基酚。37 ℃水浴，振搖溫孵 30 min。 加 1 m L冰冷的 20%三氯醋酸，0.1 mL的磷酸緩沖液以終止反應。 冰浴 5 min，3 000 r/min離心 5min， 取上清液 1mL， 加 0.5mL新鮮配制的 0.1% 亞硝酸 鈉，混 勻，放 置 2 min。加 0.5 mL 0.5%氨基磺酸胺， 混勻， 放置 3 min，加 0.5 mL 0.1%N-奈乙烯二胺， 混勻， 放置于暗處60 min， 以空白管調零， 540 nm處測定吸光度值。苯胺標準曲線的制備按 “2.4” 項的方法繪制， 然后根據標準曲線計算酶活性。

2 實驗結果

2.1 廣西莪術對大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶活性的影響 與空白組比較， 廣西莪術各劑量組對 SOD和GR水平的影響沒有明顯差異 (P＞0.05)； 中劑量顯著增高 catalase(CAT) 活性 (P＜0.01)； 高劑量明顯增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)(見表 1)。

2.2 廣西莪術對大鼠肝微粒體藥物代謝酶活性的影響 與空白組比較，廣西莪術各劑量組對CYP2E1 和 UGT的活性均沒有顯著的影響 (P＞0.05)； 均明顯增高 GST活性 (P＜0.05)； 低劑量顯著 降 低 NADPH-細 胞 色 素 P-450 還 原 酶 活 性(P＜0.05)，各劑量組明顯降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥鈉組明顯增高 CYP3A、GST和UGT的活性 (P＜0.05)， (見表2)。

表 1 廣西莪術對大鼠胞漿液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影響 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 1 廣西莪術對大鼠胞漿液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影響 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量/(g·kg-1) CAT /(U·mgprot-1) SOD /(U·mgprot-1) GSH-Px /(活力單位) GR /(U·gprot-1)空白組-271.35 ±51.59250.55 ±33.43346.16 ±34.613.73 ±2.03廣西莪術低0.81268.23 ±30.67285.89 ±49.56353.37 ±76.276.80 ±6.44廣西莪術中2.43375.57 ±33.54**266.45 ±49.79396.92 ±132.275.64 ±5.22廣西莪術高7.29269.94 ±33.56275.87 ±23.87430.38 ±82.63*6.36 ±6.36

表 2 廣西莪術對大鼠肝微粒體內 NADPH-細胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影響 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 2 廣西莪術對大鼠肝微粒體內 NADPH-細胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影響 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量/(g·kg-1) P-450 還原酶/(nmol細胞色素C·min-1·mg-1) CYP3A /(nmol· min-1·mg-1) CYP2E1 /(nmol·min-1· mg-1) GST /(U· mgprot-1) UGT /(nmol·min-1· mgprot-1)空白組-0.51 ±0.131.52 ±0.9314.84 ±3.0317.45 ±4.580.13 ±0.03廣西莪術低0.810.19 ±0.10*0.61 ±0.80*17.21 ±5.5633.57 ±17.63*0.10 ±0.04廣西莪術中2.430.29 ±0.150.42 ±0.67**15.60 ±2.4936.69 ±21.58*0.10 ±0.04廣西莪術高7.290.44 ±0.340.27 ±0.33**22.63 ±9.4240.20 ±15.11**0.10 ±0.04陽性組(苯巴比妥)0.08-3.03 ±1.10**-30.63 ±11.92*0.18 ±0.04*

3 討論

3.1 廣西莪術對胞漿液抗氧化酶的影響 抗氧化酶 SOD、 CAT、 GSH-Px等是機體內抗氧化系統的主要組分，其作用是及時清除體內代謝過程中產生的各種自由基、氧化還原產物、過氧化物等。直接或間接保護機體細胞免受自由基、氧化還原產物、過氧化物損傷［6-7］。

本試驗研究結果表明，在灌胃給予廣西莪術水煎液后，在肝臟胞漿液中，中、高劑量組可不同程度增高 CAT和 GSH-Px的活性， 提示廣西莪術在較大劑量時能夠增強大鼠肝臟的抗氧化能力。

3.2 廣西莪術對藥物代謝酶的影響 藥物相互作用最常見的原因是藥物代謝酶酶的誘導或抑制，中藥用藥以復方水煎液或單味藥材的水煎液為主，一個方劑含有多種中藥，一種單味藥材的水煎液也可能含有成千上萬或更多種成分。因此對中藥進行藥物代謝酶的研究，有助于闡明中藥作用機制及毒副作用發生機制，對臨床合理用藥具有指導作用。

細胞色素 P450(cytochrome P450， CYP) 是廣泛存在于生物體內的一類含血紅素和硫羥基的蛋白質， 是一超家族藥物代謝酶系［8］。 NADPH-細胞色素 P450 還 原 酶 (NADPH cytochrome P450 reductase， CPR) 是 CYP酶可提供 CYP酶系氧化還原反應所需的第 1個電子，其表達的缺失將抑制CYPP450 酶的活力［9］。 本研究結果發現廣西莪術在低、 中劑量時對 CPR活性有明顯的降低作用，具體原因有待進一步研究。

CYP3A是肝臟與小腸中含量最為豐富的藥物代謝酶， 臨床常用藥物中亦約有 50%經由 CYP3A代謝［10］。 本實驗結果顯示， 廣西莪術各劑量組明顯地抑制大鼠 CYP3A的活性。 臨床上當 CYP3A底物類藥物如紅霉素、他汀類藥物、硝苯地平、環孢素等與廣西莪術合并用藥時，應考慮到可能存在潛在的代謝性藥物相互作用。

CYP2E1 在肝 臟中占 肝細胞 色素酶 總量的7%［11］。 CYP2E1 不但參與部分藥物的代謝， 而且還能催化許多前致癌物和毒物的活化過程［11］。 本實驗結果顯示， 廣西莪術對 CYP2E1 活性沒有明顯的影響。

谷胱甘肽 S-轉移酶 (GST) 和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶 (UGT) 是Ⅱ相主要的藥物代謝酶， 主要參與藥物的結合代謝， GST催化還原型谷胱甘肽與一系列親電子化合物結合，對進入體內的親電子致癌物、外源性毒物起解毒和保護作用［12-13］，UGT催 化大 多 數 藥物、 致 癌物、 毒 物 等與葡萄糖醛結合而代謝、 解毒、 排泄［14］。 GST分布于大多數組織，如肝臟、腸道、腎臟、睪丸、腎上腺和肺，其中又以肝臟最多。廣西莪術各劑量組對 GST均有明顯的誘導作用。 說明廣西莪術可加速代謝排出體內毒性化學物質，增加肝臟的解毒能力。本研究顯示，與空白組相比，廣西莪術對UGT沒有明顯的影響。

苯巴比妥鈉是 CYP3A、 GST和 UGT的經典誘導劑。本實驗研究結果同樣也顯示苯巴比妥鈉能顯著升高 CYP3A、 GST和 UGT的活性。

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Effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom a on liver antioxidant enzymes in cytosols and drugm etabolizing enzym es in m icrosomes in liver of rats

YANG Xiu-fen1， SHIWei-zhou2， CHENG Yun-xiang1， FAN Xing-hua1
(1.Department of Pharmacology， Faculty of Pharmacy， Guangxi University Of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Department of Pharmacy， The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， China)

AIM To study the effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom(ECKR)on liver antioxidant enzymes in cytosols and drug metabolic enzymes in microsomes in liver of rats.MEHTODS Cytosols and microsomes were isolated from liver and prepared by differential centrifugation using the standard procedure. The activities of antioxidant enzymes and drugmetabolic enzymeswere determined by UV-Vis spectrophotometer. RESULTS In cytosols， all dosages of ECKR showed no effecton SOD and GR(P＞0.05)compored to the control group.Medium dosage(2.43 g/kg)significantly increased the activities of catalase(CAT)(P＜0.05) ，and the highest dose sharply increased the activities of GSH-PX(P＜0.05).In microsomes， compared with the control group，all dosages of ECKR had no effecton the activities of CYP2E1， UGT's activities，butallsignificantly increased the activities of GST(P＜0.05).Low dosage(ECKR 0.81 g/kg)decreased the activities of NADPH cytochrome P450 reductase(P＜0.05).All of ECKR groups significantly reduced the activities of CYP3A(P＜0.05).The positive control group(phenobabital)induced the activity of CYP3A， GST and UGT obviously(P＜0.05).CONCLUSION ECKRmay affect drugmetabolism in vivo.There fore， drug-drug interactions should beconsidered when ECRR is used with other drugs.

Curcuma kwangsiensis rhizoma； antioxidant enzymes； drugmetabolic enzymes

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0221-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.001

2013-03-04

國家自然科學基金 (81060353) ； “教育部新世紀優秀人才支持計劃人選” 資助項目 ( 教技函 2010-14 號， NCET-10-0093)；廣西自然科學基金項目 (2011GXNSFF018006)。

楊秀芬 (1969—)， 男， 醫學博士， 教授， 碩士生導師， 研究方向: 活血化瘀類中藥對藥物代謝酶和抗氧化酶活性的影響。Tel:(0771)2279423， E-mail:xiufenyang@163.com