微生物吸光值法定量檢測實驗

陳杰+++張振遠

摘 要：通過對鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室提供的巴氏芽孢桿菌的培養，分別取相同菌量1ml菌懸液（OD600=1.0440），按相應體積倍數稀釋后，測定各OD600值。數據的擬合發現，全部稀釋倍數乘冪關系擬合線擬合度不高，OD600值大于1或小于0.2時，越靠近坐標軸，數據越失真，誤差越大。截取0.2～1.0之間的OD600值，擬合乘冪曲線為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976），應用簡單倍數關系y=1.044/x換算，兩者誤差都維持在5%之內。OD600值在0.2～1.0之間運用簡單倍數關系換算準確、快捷。

關鍵詞：菌量；快捷；最優區間；倍數關系

1 引言

微生物在人類生產生活中體現的特殊優勢早已出現，如污水治理中重金屬離子的細菌吸附[1]、礦業工程的生物浸出[2]、巖土工程的生物固化[3-4]等等，微生物已成為國內外研究的熱點。

在研究微生物的過程中，對微生物量的測定是必須的一個過程。測定微生物生長的方法很多，可分為直接法和間接法兩大類。直接法有粗放的測體積法（在刻度離心管中測沉降值）和精確的稱干重法。間接法有比濁法和生理指標法[5]。比濁法是實驗室中經常使用的一種方法，用分光光度計選定一定波長（450nm～650nm），對微生物懸浮液進行吸光度的測定[6]。比濁法適用范圍廣，測量值在一定的區間內比較準確、可靠[7]。

采用比濁法測定的OD值，與細菌的濃度在一定范圍內是呈現著正比例的關系[8]。實驗室中經常會遇到菌懸液稀釋的問題，稀釋后的菌懸液OD值和初始的懸液OD值的關系卻也不是簡單的倍數關系，而是呈現出一種乘冪關系[9]。較高的初始OD值需要稀釋且較低的OD值需濃縮后才能用于測定，而不能直接測定以防止檢測結果的不準確性，出現較大的誤差甚至是錯誤[10]。

為此，準確測定細菌菌液濃度，了解在一定OD值范圍內，稀釋倍數與稀釋OD值的關系及準確快速進行菌量比較的方法在對實驗數據的相關換算方面有著一定的意義。

2 材料和方法

2.1 儀器設備

AL 104電子天平、VB-40高壓滅菌鍋（德國systec）、SW-CJ-1FD潔凈工作臺、小容量恒溫高速培養振蕩器搖床（SHP-200D）、微量冷凍離心機（5415R Germany）、蛋白核酸測定儀（biophotometer eppendorf Germany）、pHS-3C酸度計、eppendorf移液槍

2.2 菌種

保存在超低溫冰箱的巴氏芽孢桿菌單一菌株，菌種由鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室提供。

2.3 細菌培養

培養基成分為酵母提取物20g/L、氯化銨10g/L及去離子水，pH調至8.5，過濾滅菌器經高壓滅菌鍋滅菌后，放置潔凈工作臺對培養基進行過濾滅菌。每100ml培養液放置在250ml錐形瓶中，母液（OD600值1.500）1：100接種，放置搖床中，溫度30℃，轉速200r/min。

2.4 細菌懸液制備

放置搖床8h后，取出菌液。取30支2ml的離心管，1000μL移液槍準確移取菌液，每離心管1ml。30支離心管分A、B兩批，每批15支，分別放置于離心機中，轉速10000rpm，溫度4℃，離心10分鐘，離心后吸除上清液，用2ml生理鹽水沖洗細菌，再次離心。重復沖洗離心一次。分別將離心之后的細菌用生理鹽水稀釋成0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml。

2.5 OD600值的測定

以生理鹽水為空白樣，用蛋白核酸測定儀測定各樣品OD600值。

3 實驗結果與討論

實驗記錄數據如表1。

截取OD600值0.2～1的數據，乘冪關系擬合圖為圖2。

圖1對于全部稀釋倍數（0.3～12.5），用乘冪關系擬合后，擬合程度不高（R2=0.9258<0.95），在0

圖2截取OD600值0.2～1的數據，乘冪關系擬合，R2=0.9976。原始數據帶入擬合公式y=1.0764x-1.0115（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數），分別得出y1～y5及所對應的誤差δ1～δ5（如表2）。最大誤差為δ4.5=4.10%，最小誤差為δ3=0.56%，對實驗數據的換算具有較高的準確性，且能達到99.44%。

實際的菌液稀釋換算中簡單的倍數關系更加的快捷易于把握，用公式y=1.044x-1（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數）換算，分別得出y'1～y'5及所對應的誤差δ'1～δ'5（如表2）。最大誤差為δ'1.5=5.33%，最小誤差為δ'4=0.80%，在0.2

兩次換算結果數據如表2。

從表2中對比得出：OD600值在1～0.2區間上，兩種換算關系結果的誤差維持在5%的水平，具有較高的精確度，而超過這一范圍即OD600值在大于1或者小于0.2時，越靠近坐標軸任意兩種換算的結果誤差就越大，失去了換算的指導意義。菌懸液稀釋曲線呈現的是乘冪關系和徐風[9]等人的結論一致。簡單的倍數關系曲線更易于換算和把握，與陶海靜[11]的結論相似。實際應用過程中，在特定的范圍內（OD600值在1～0.2之間），將高濃度的菌懸液稀釋到此區間，用簡單的倍數換算就可以得到較為精確的換算值，方便于不同菌懸液菌量的比較。

4 結論

（1）菌懸液稀釋倍數與稀釋OD600值不是呈現出簡單的倍數關系，而是區間性的乘冪關系或是區間性的簡單倍數關系。

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數與稀釋OD600值的乘冪關系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數），同樣在此區間內滿足簡單倍數關系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應處在0.2～1.0之間，應用簡單的倍數關系換算，準確度達到95%，提高了實驗數據的準確性及比較換算的快捷性。

參考文獻

[1]Mohamed，ZA，El-Sharouny，HM，Ali，WS et al. Microcystin concentrations in the Nile River sediments and removal of microcystin-LR by sediments during batch experiments[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2007，04：489-495.

[2]DELVASTO P， VALVERDE A， BALLESTER A. Diversity and activity of phosphate bioleaching bacteria from a high-phosphorus iron ore[J].hydromet，2008，92：124-129.

[3]Hamed A. Keykha， Bujang B.K.Huat， Afshin Asadi. Electro-Biogrouting and Its Challenges[J].International Journal of Electrochemical Science，2012，7：1196-1204.

[4]A.AL QABANY，K.SOGA.Effect of chemical treatment used in MICP on engineering properties of cemented soils[J].Geotechnique，2013，04：331-339.

[5]羅映輝，鄔國軍，余俊龍，夏忠弟，文質.細菌繁殖與計數新方法的實驗研究[J].實用預防醫學，2003，05：828-829.

[6]李紹戊，楊洪波，王荻等.用紫外分光光度法測定嗜水氣單胞菌的濃度[J].水產學雜志，2013，02：40-42.

[7]莫繼先，王志剛，王昌河.常見微生物數量測定方法比較[J].生物學教學，2012，01：42-43.

[8]李冬陽，茹柿平，吳堅等.分光光度法快速檢測細菌[J].分析化學，2010，04：573-576.

[9]徐鳳，雷萍.菌懸液稀釋倍數與OD_（600）的關系實驗[J].環?？萍迹?010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，鄺哲師，等.桑樹青枯病菌紫外分光度計菌方法的研究[J].廣東蠶業，2008，03：42-44.

[11]陶海靜.雞大腸桿菌計數方法研究[J]. 安徽農業科學，2007， 27：8504-8504+8516.

*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學核資源工程學院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數與稀釋OD600值的乘冪關系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數），同樣在此區間內滿足簡單倍數關系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應處在0.2～1.0之間，應用簡單的倍數關系換算，準確度達到95%，提高了實驗數據的準確性及比較換算的快捷性。

參考文獻

[1]Mohamed，ZA，El-Sharouny，HM，Ali，WS et al. Microcystin concentrations in the Nile River sediments and removal of microcystin-LR by sediments during batch experiments[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2007，04：489-495.

[2]DELVASTO P， VALVERDE A， BALLESTER A. Diversity and activity of phosphate bioleaching bacteria from a high-phosphorus iron ore[J].hydromet，2008，92：124-129.

[3]Hamed A. Keykha， Bujang B.K.Huat， Afshin Asadi. Electro-Biogrouting and Its Challenges[J].International Journal of Electrochemical Science，2012，7：1196-1204.

[4]A.AL QABANY，K.SOGA.Effect of chemical treatment used in MICP on engineering properties of cemented soils[J].Geotechnique，2013，04：331-339.

[5]羅映輝，鄔國軍，余俊龍，夏忠弟，文質.細菌繁殖與計數新方法的實驗研究[J].實用預防醫學，2003，05：828-829.

[6]李紹戊，楊洪波，王荻等.用紫外分光光度法測定嗜水氣單胞菌的濃度[J].水產學雜志，2013，02：40-42.

[7]莫繼先，王志剛，王昌河.常見微生物數量測定方法比較[J].生物學教學，2012，01：42-43.

[8]李冬陽，茹柿平，吳堅等.分光光度法快速檢測細菌[J].分析化學，2010，04：573-576.

[9]徐鳳，雷萍.菌懸液稀釋倍數與OD_（600）的關系實驗[J].環?？萍?，2010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，鄺哲師，等.桑樹青枯病菌紫外分光度計菌方法的研究[J].廣東蠶業，2008，03：42-44.

[11]陶海靜.雞大腸桿菌計數方法研究[J]. 安徽農業科學，2007， 27：8504-8504+8516.

*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學核資源工程學院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數與稀釋OD600值的乘冪關系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數），同樣在此區間內滿足簡單倍數關系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應處在0.2～1.0之間，應用簡單的倍數關系換算，準確度達到95%，提高了實驗數據的準確性及比較換算的快捷性。

參考文獻

[1]Mohamed，ZA，El-Sharouny，HM，Ali，WS et al. Microcystin concentrations in the Nile River sediments and removal of microcystin-LR by sediments during batch experiments[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2007，04：489-495.

[2]DELVASTO P， VALVERDE A， BALLESTER A. Diversity and activity of phosphate bioleaching bacteria from a high-phosphorus iron ore[J].hydromet，2008，92：124-129.

[3]Hamed A. Keykha， Bujang B.K.Huat， Afshin Asadi. Electro-Biogrouting and Its Challenges[J].International Journal of Electrochemical Science，2012，7：1196-1204.

[4]A.AL QABANY，K.SOGA.Effect of chemical treatment used in MICP on engineering properties of cemented soils[J].Geotechnique，2013，04：331-339.

[5]羅映輝，鄔國軍，余俊龍，夏忠弟，文質.細菌繁殖與計數新方法的實驗研究[J].實用預防醫學，2003，05：828-829.

[6]李紹戊，楊洪波，王荻等.用紫外分光光度法測定嗜水氣單胞菌的濃度[J].水產學雜志，2013，02：40-42.

[7]莫繼先，王志剛，王昌河.常見微生物數量測定方法比較[J].生物學教學，2012，01：42-43.

[8]李冬陽，茹柿平，吳堅等.分光光度法快速檢測細菌[J].分析化學，2010，04：573-576.

[9]徐鳳，雷萍.菌懸液稀釋倍數與OD_（600）的關系實驗[J].環保科技，2010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，鄺哲師，等.桑樹青枯病菌紫外分光度計菌方法的研究[J].廣東蠶業，2008，03：42-44.

[11]陶海靜.雞大腸桿菌計數方法研究[J]. 安徽農業科學，2007， 27：8504-8504+8516.

*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學核資源工程學院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint