對(duì)蝦白斑綜合癥病毒極早期基因的研究進(jìn)展

冉曉卓 李鈁

（國(guó)家海洋局第三海洋研究所 國(guó)家海洋局生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361005）

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒極早期基因的研究進(jìn)展

冉曉卓 李鈁

（國(guó)家海洋局第三海洋研究所 國(guó)家海洋局生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361005）

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。WSSV在侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，極早期基因（immediate-early gene）對(duì)病毒復(fù)制增殖起著非常重要的作用。在這個(gè)過(guò)程中，一方面極早期基因編碼的蛋白通過(guò)與細(xì)胞調(diào)控因子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，為病毒的增殖提供更合適的環(huán)境；另一方面，極早期蛋白直接調(diào)控病毒基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。綜述列舉了WSSV的21個(gè)極早期基因，并將重點(diǎn)介紹其中5個(gè)研究比較深入的基因：ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

WSSV極早期基因 ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是對(duì)蝦的主要病原之一，具有極強(qiáng)的感染力和致死性［1］。自從1992年WSSV第一次被科學(xué)家檢測(cè)出，WSSV已經(jīng)傳播至世界各地，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了極大的危害［2］。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，WSSV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，隸屬于線性病毒科（Nimaviridae），白斑病毒屬（Whispovirus）［3］。對(duì)于雙鏈DNA病毒而言，其基因組的表達(dá)呈時(shí)序性，可分為極早期（Immediate-early），早期（Early）和晚期（Late）。在病毒感染的極早期，沒(méi)有病毒DNA復(fù)制，沒(méi)有新病毒蛋白合成的情況下，少數(shù)病毒基因可以被宿主細(xì)胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)錄機(jī)器”啟動(dòng)，并利用宿主細(xì)胞RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這些基因的表達(dá)依賴于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，并且不需要新病毒蛋白的合成，被定義為病毒極早期基因（Immediate-early gene）。極早期基因編碼的蛋白，即極早期蛋白，通常是一些調(diào)控因子，在病毒的復(fù)制過(guò)程中對(duì)病毒自身和宿主細(xì)胞起著非常重要的調(diào)控作用。一方面極早期蛋白參與調(diào)控病毒早期基因和晚期基因的表達(dá)；另一方面，極早期蛋白可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子相互作用，調(diào)控宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)或者幫助病毒躲避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，從而為病毒增殖創(chuàng)造合適的環(huán)境。例如，皰疹病毒HSV-1極早期蛋白ICP0（Infected-cell protein 0）既可以激活病毒下游基因的表達(dá)，也可以與宿主細(xì)胞ND10（Nuclear domain 10）結(jié)合，破壞ND10的結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解，干擾宿主的免疫反應(yīng)［4］。由此可見(jiàn)，極早期蛋白在病毒增殖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

通常實(shí)驗(yàn)室中采用抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的方法來(lái)篩選病毒的極早期基因。放線菌酮（Cycloheximide，CHX）是一種可以干擾蛋白質(zhì)合成中的延長(zhǎng)步驟而有效地抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的化合物。實(shí)驗(yàn)中通常將細(xì)胞用CHX處理一段時(shí)間，阻斷新蛋白合成，然后進(jìn)行病毒感染。病毒極早期基因可以利用已經(jīng)存在的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所以其轉(zhuǎn)錄不會(huì)受到CHX處理的影響。而病毒其他基因的轉(zhuǎn)錄由于需要病毒極早期蛋白的調(diào)控，因此會(huì)受到CHX的抑制。利用這個(gè)原理，2005年，中國(guó)臺(tái)灣研究人員Liu等［5］第一次用基因芯片技術(shù)結(jié)合RT-PCR，篩選并鑒定出3個(gè)WSSV極早期基因，并將它們命名為ie1、ie2和ie3。2009年，李鈁等［6］也利用這種方法鑒定出了16個(gè)極早期基因，包括wsv051、wsv069（ie1）、wsv078、wsv079、wsv080、wsv083、wsv091、wsv094、wsv098、wsv099、wsv100、wsv101、wsv103、wsv108、wsv178和wsv249。2011年，林梵宇等［7］使用EGFP作為報(bào)告基因檢測(cè)啟動(dòng)子活性，結(jié)合CHX處理實(shí)驗(yàn)再次鑒定出wsv056、wsv403和wsv465三個(gè)WSSV極早期基因。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的WSSV的極早期基因已經(jīng)達(dá)到21個(gè)，如表1所示。

盡管對(duì)WSSV的研究有了很大的進(jìn)展，但是人類對(duì)WSSV極早期基因的了解仍然有限。目前對(duì)WSSV極早期基因的研究主要分為兩個(gè)方面，一是對(duì)于極早期基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，還有一方面是對(duì)極早期蛋白功能的研究。研究的比較多的是WSSV極早期基因ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

1 對(duì)極早期基因iel、wsv051、wsv083、wsv-249和wsv403的相關(guān)研究

1.1 對(duì)極早期基因ie1的相關(guān)研究

ie1是目前研究得最深入的WSSV極早期基因。在病毒入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的抗病毒機(jī)制被激活。在這樣的條件下，WSSV極早期基因ie1由于自身的一些特殊結(jié)構(gòu)，能選擇性的利用各種調(diào)節(jié)因子增強(qiáng)自身的表達(dá)。同時(shí)，ie1編碼的極早期蛋白可以通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。

1.1.1 對(duì)WSSV極早期基因ie1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究 WSSV極早期基因ie1的啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。這種強(qiáng)啟動(dòng)子活性不光存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，還存在于非宿主細(xì)胞內(nèi)（sf-9細(xì)胞）。曾經(jīng)有研究者把ie1的啟動(dòng)子活性和CMV（Cytomegalovirus immediate-early）啟動(dòng)子進(jìn)行過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在sf-9細(xì)胞中，ie1的啟動(dòng)子活性比CMV還要強(qiáng)［14］。這種強(qiáng)啟動(dòng)子活性主要存在于從-92到-74的這一段序列。如果這一段序列發(fā)生缺失或者突變，那么啟動(dòng)子的活性喪失。ie1的啟動(dòng)子上存在著一系列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，ie1啟動(dòng)子通過(guò)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的作用來(lái)增強(qiáng)IE1的表達(dá)。

1.1.1.1ie1利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）增強(qiáng)自身的轉(zhuǎn)錄 在宿主細(xì)胞中，STAT在宿主抵抗病毒侵染的過(guò)程中起著很重要的作用。STAT蛋白中與其功能密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)包括它的蛋白結(jié)合區(qū)域，DNA結(jié)合區(qū)域，SH結(jié)合區(qū)域和一個(gè)C端Tyr殘基。當(dāng)STAT的Tyr殘基被磷酸化的時(shí)候，STAT被運(yùn)送到細(xì)胞核中，與相關(guān)DNA結(jié)合，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄［15］。在這個(gè)過(guò)程中，JAK-STAT通路（通常認(rèn)為與細(xì)胞內(nèi)抗病毒機(jī)制有關(guān)）會(huì)被激活，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)［16］。當(dāng)WSSV侵入宿主細(xì)胞時(shí)，STAT本身被活化定位到細(xì)胞核中，結(jié)合到ie1啟動(dòng)子上STAT結(jié)合區(qū)域，即從-84到-64的這段序列（ATTCCTAGAAA），直接增強(qiáng)IE1的表達(dá)［17］。但是這個(gè)結(jié)合的過(guò)程并不破壞STAT的結(jié)構(gòu)，STAT仍然保持原有的活性，能夠激活JAK-STAT通路［18］。上述研究表明，極早期基因ie1可以利用宿主細(xì)胞的JAK-STAT通路來(lái)增強(qiáng)自身表達(dá)。

1.1.1.2ie1利用PHB2增強(qiáng)自身轉(zhuǎn)錄 PHB2（Prohibitin 2）蛋白既可以存在于線粒體內(nèi)，也可以存在于細(xì)胞核內(nèi)。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中它可以作為共作用因子通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性［19］。研究表明，在對(duì)蝦細(xì)胞中，PHB2的C端存在一個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)（Helix-turnhelix domain，HTH domain），因此它還可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到ie1啟動(dòng)子上調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。ie1啟動(dòng)子的-78到-66這一段序列可以與PHB2的HTH domain結(jié)合，增強(qiáng)IE1的表達(dá)［20］。

1.1.1.3ie1利用NF-κB增強(qiáng)自身轉(zhuǎn)錄 IKKβ（IκB kinase β）和IKKε（IκB kinase ε）是NF-κB（Nuclear factor κB）通路最關(guān)鍵的調(diào)控因子。NF-κB通路的活化涉及到一系列的磷酸化和泛素化反應(yīng)，釋放出炎癥因子，召集相關(guān)的免疫細(xì)胞來(lái)清除入侵的病原體。IKKβ通過(guò)調(diào)節(jié)IκBα（Inhibitor of NF-κBα）的磷酸化，開(kāi)啟NF-κB通路。IKKε 則是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的AMP（Antimicrobial peptide genes）表達(dá)，開(kāi)啟NF-κB通路［21］。IKKβ和IKKε的過(guò)表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致NF-κB通路的活化。研究表明WSSV可以利用IKKNF-κB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括了極早期基因ie1、wsv051和wsv083［22］。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)對(duì)蝦的NF-κB同源蛋白LvRelish可以直接結(jié)合到ie1啟動(dòng)子上，激活ie1轉(zhuǎn)錄［23］。

1.1.2 對(duì)極早期基因ie1編碼的蛋白的研究 WSSV極早期蛋白IE1是由極早期基因ie1編碼的蛋白，全長(zhǎng)224個(gè)氨基酸。在IE1上面存在著多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和DNA結(jié)合位點(diǎn)。在C端有DNA結(jié)合位點(diǎn)和硫氧化還原蛋白（Thioredoxin，Trx）結(jié)合位點(diǎn)，在靠近N段的位置有TATA box結(jié)合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）結(jié)合位點(diǎn)。IE1可以通過(guò)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)。

1.1.2.1 IE1具有轉(zhuǎn)錄因子的特性 很多病毒極早期基因可以編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子通常具有以下功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transactivation domain，TAD）。DBD可以使轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合到目標(biāo)序列上，TAD可以和轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用促進(jìn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，IE1同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和DNA結(jié)合的能力，其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域存在于蛋白質(zhì)C端前80個(gè)氨基酸中，而DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于C端第81個(gè)氨基酸到第224個(gè)氨基酸之間。此外當(dāng)IE1與DNA結(jié)合時(shí)，IE1可以自身發(fā)生相互作用，形成二聚體［24］。因此IE1可能以同源二聚體形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。

1.1.2.2 IE1與對(duì)蝦TATA box結(jié)合蛋白PmTBP結(jié)合促進(jìn)病毒基因的表達(dá) 在真核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD（Transcription factorⅡD）對(duì)于DNA的轉(zhuǎn)錄是必須的。TFⅡD由一個(gè)TATA box結(jié)合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和TBP相關(guān)因子（ TATA-binding protein associated factors，TAFs）組成［25］。根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，很多病毒極早期蛋白，如腺病毒的E1A（A viral oncoprotein of adenvirus）和皰疹病毒的Zta（A viral transcription factor of EBV）都是通過(guò)與TBP的結(jié)合來(lái)促進(jìn)自身的轉(zhuǎn)錄［26，27］。WSSV 極早期蛋白IE1也可以與對(duì)蝦TATA-box結(jié)合蛋白（Penaeus monodonTATA box-binding protein，PmTBP）結(jié)合。IE1的81-180位氨基酸可以分別與PmTBP的171-230位和111-300位氨基酸發(fā)生相互作用。RNA干擾實(shí)驗(yàn)證明，這種結(jié)合促進(jìn)了病毒早期基因DNA polymerase gene的表達(dá)，因此IE1和PmTBP的相互作用能夠影響病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖［8］。

1.1.2.3 IE1可以與成視網(wǎng)膜瘤蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，RB與E2F轉(zhuǎn)錄因子的相互作用可以調(diào)控細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期。當(dāng)RB與E2F結(jié)合形成蛋白復(fù)合體時(shí)，E2F的活性被抑制；當(dāng)RB與某些調(diào)控蛋白結(jié)合后，RB-E2F復(fù)合體解離，釋放出E2F蛋白，使之能夠結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄［28］。E2F調(diào)控的下游蛋白通常與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，包括 DNA polymerase subunitⅡ、PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）、Thymidilate synthetase，cdc2、cyclin E、UNG（Uracil-N-glycosylase）、BRCA1（Breast cancer 1）、MCM2（Minichromosome maintenance protein 2）和MCM6（Minichromosome maintenance protein 6）［29］。這些蛋白的表達(dá)會(huì)促使細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。對(duì)WSSV的研究表明，IE1蛋白可以通過(guò)其C末端的“LxCxE”結(jié)構(gòu)域與RB結(jié)合；這種相互作用導(dǎo)致RB-E2F復(fù)合體的解離，使E2F活化。活化的E2F調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期［9］。

1.1.2.4 硫氧化還原蛋白可以修復(fù)IE1結(jié)合DNA的能力 硫氧化還原蛋白（Thioredoxin，Trx）是一個(gè)12 kD大小的蛋白，其主要的功能是氧化還原。實(shí)驗(yàn)證明，在WSSV感染細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量明顯下降，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，IE1遇到活性氧被氧化，喪失了結(jié)合DNA的能力。被氧化的IE1可以與Trx結(jié)合，結(jié)合的位點(diǎn)是在62位的Cys。IE1通過(guò)與Trx的結(jié)合可以修復(fù)IE1結(jié)合DNA的能力，恢復(fù)其原有的功能，有利于病毒的增殖［30］。

1.2 對(duì)極早期基因wsv051的相關(guān)研究

極早期基因wsv051經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生極早期蛋白WSV051。WSV051是一個(gè)由196個(gè)氨基酸組成的蛋白，科學(xué)家推測(cè)其可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。WSV051蛋白中存在兩個(gè)小泛素相關(guān)修飾（Small ubiquitin-like modification，SUMOylation）位點(diǎn)。小泛素相關(guān)修飾是一種翻譯后蛋白共價(jià)修飾，對(duì)蛋白功能起著微調(diào)的作用。E2結(jié)合酶UBC9（SUMO ubiquitin-conjugating enzyme 9 ）是小泛素相關(guān)修飾過(guò)程中最重要的蛋白分子［31］。在該過(guò)程中，活化E1激活酶后，小泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）小分子轉(zhuǎn)移到UBC9的第93位Cys，然后SUMO從UBC9傳遞到底物上［32］。很多病毒極早期蛋白，如皰疹病毒極早期蛋白IE2，通過(guò)參與SUMO化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)［33］。在WSSV侵染的過(guò)程中，極早期蛋白WSV051被UBC9調(diào)節(jié)的SUMO化作用修飾，這一修飾可以避免該蛋白被細(xì)胞內(nèi)的泛素化途徑降解。RNA干擾結(jié)果證明如果UBC9或者SUMO的表達(dá)受到抑制，則WSSV早期和晚期基因的表達(dá)也會(huì)受到抑制。根據(jù)這個(gè)結(jié)果科學(xué)家推測(cè)WSV051通過(guò)SUMO化修飾延長(zhǎng)自身在細(xì)胞中的半衰期，進(jìn)而可能促進(jìn)病毒早期和晚期基因的表達(dá)，有利于WSSV在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖［10］。

1.3 對(duì)極早期基因wsv083的相關(guān)研究

1.3.1 對(duì)極早期基因wsv083轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究wsv-083的啟動(dòng)子含有一段TGACGT（G/C）A的序列，可以與對(duì)蝦的XBP（X-box binding protein 1）蛋白結(jié)合啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白的折疊以及蛋白的修飾的細(xì)胞器。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞的時(shí)候，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)法正常折疊的蛋白，這種由外部干擾因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失常的現(xiàn)象，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力（ER-stress）［34］。真核生物細(xì)胞中存在一套完整的非折疊蛋白反應(yīng)機(jī)制（Unfolded protein response，UPR）來(lái)應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。UPR涉及3個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：（1）IRE1-XBP1通路（Inositol-requiring 1/X box binding protein 1 pathway）；（2）PERK-eIF-2α通路（Double-stranded RNA-activated protein kinase（PER）-like endoplasmic reticulum kinase/Eukaryotic initiation factor 2α pathway）；（3）ATF6通 路（Activating transcription factor 6 pathway）［34，35］。UPR通過(guò)減少蛋白的翻譯、增加分子伴侶表達(dá)，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白降解［36］等途徑來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)非正確折疊的蛋白的含量，保持細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)證明，在WSSV侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，LvXBP是對(duì)蝦細(xì)胞內(nèi)最主要的UPR通路調(diào)控因子。LvXBP含有一個(gè)BRLZ功能結(jié)構(gòu)域，可以促進(jìn)極早期基因wsv083的轉(zhuǎn)錄。因此，WSSV可能通過(guò)調(diào)節(jié)UPR通路，選擇性的使用UBP轉(zhuǎn)錄因子來(lái)增強(qiáng)自身基因的表達(dá)［37］。

1.3.2 對(duì)極早期基因wsv083編碼的蛋白的研究 WSV083是一個(gè)由581個(gè)氨基酸組成的蛋白，含有Ser/Thr磷酸化激酶功能結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)表明WSV083可以通過(guò)抑制Tyr的磷酸化，降低FAK的活性。由于FAK是一種與細(xì)胞黏附性有關(guān)的蛋白，F(xiàn)AK活性的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞黏附性的下降。而無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的黏附性在免疫機(jī)制中起著重要的作用。因此，WSV083對(duì)FAK通路的調(diào)控可能使病毒更加容易攻擊宿主免疫系統(tǒng)［11］。

1.4 對(duì)極早期基因wsv249的相關(guān)研究

極早期基因wsv249經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生極早期蛋白WSV249。WSV249是一個(gè)由783個(gè)氨基酸組成的蛋白。通常在真核細(xì)胞中，依賴泛素的蛋白水解是用來(lái)調(diào)控蛋白豐度，從而在細(xì)胞周期，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA修復(fù)和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用［38］。在泛素化過(guò)程中，通常會(huì)有3種酶參與作用，它們分別是泛素活化酶E1（Ubiqutin-activating enzyme），泛素結(jié)合酶E2（Ubiqutin-conjugating enzyme）和泛素連接酶E3（Ubiqutin-ligase enzyme）［38］。通常E3連接酶都是含有環(huán)指結(jié)構(gòu)（Ring finger）的蛋白，而環(huán)指結(jié)構(gòu)又分為兩大類RING-HC和RING-H2［39，40］。WSV249含有RING-H2結(jié)構(gòu)域，可以與PvUbc（Ubc homology inPenaeus vannamei）結(jié)合，使底物泛素化，因此是一種泛素連接酶［12］。許多病毒能夠直接利用細(xì)胞內(nèi)的泛素化途徑降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，從而有利于自身的增殖［41］。因此WSV249可能在WSSV感染中起到類似的作用。

1.5 對(duì)極早期基因wsv403的相關(guān)研究

極早期基因wsv403經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生極早期蛋白WSV403。WSV403是一個(gè)由641個(gè)氨基酸組成的蛋白，包含了一個(gè)RING-H2環(huán)指結(jié)構(gòu)，也是一種E3泛素化連接酶，可以被E2泛素結(jié)合酶活化。實(shí)驗(yàn)表明wsv403是一種與病毒潛伏期有關(guān)的基因，該基因在潛伏期和復(fù)制期皆有表達(dá)，而且隨著復(fù)制感染的進(jìn)程表達(dá)量逐漸提高。鑒于WSV403可以和對(duì)蝦細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PPs）結(jié)合，研究者推測(cè)WSV403的表達(dá)有可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平來(lái)對(duì)病毒潛伏期-復(fù)制期的轉(zhuǎn)換進(jìn)行調(diào)控［13］。

2 對(duì)WSSV極早期基因啟動(dòng)子的研究

目前，除了對(duì)WSSV極早期基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和結(jié)構(gòu)功能有所研究外，對(duì)極早期基因啟動(dòng)子活性的研究也有一定的進(jìn)展。正如前面提到的在2008年就有研究者把ie1的啟動(dòng)子活性和CMV進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)ie1的啟動(dòng)子活性在某些細(xì)胞內(nèi)比CMV強(qiáng)［14］。在2011年，林梵宇等［7］采用EGFP作為報(bào)告基因篩選極早期基因發(fā)現(xiàn)，wsv056、wsv403和wsv465的啟動(dòng)子可以直接被細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子激活。隨后在2013年，他們對(duì)現(xiàn)有極早期基因的啟動(dòng)子做了詳細(xì)的分析，使用EGFP作為報(bào)告基因結(jié)合流式分析技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建突變體找出這些啟動(dòng)子的核心區(qū)域。在這篇報(bào)告中，他們確定了8個(gè)核心功能區(qū)域，其中cyclic AMP respnse element（CRE），即TGACGTCA這一段序列，在這些調(diào)控區(qū)中出現(xiàn)頻率很高。如果CRE功能結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，wsv403和wsv465的啟動(dòng)子活性就會(huì)喪失。這說(shuō)明CRE元件在極早期基因轉(zhuǎn)錄上有著重要的作用［42］。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)20多年的研究，人們對(duì)WSSV的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組、結(jié)構(gòu)蛋白組組成等方面有了較深入的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)WSSV感染調(diào)控機(jī)制的研究還處于起步階段。極早期蛋白是DNA病毒中最主要的一類調(diào)控因子，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，一些WSSV極早期蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理生化過(guò)程，為病毒的增殖創(chuàng)造良好的環(huán)境。此外，WSSV極早期基因可以選擇性的利用細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)自身的轉(zhuǎn)錄。鑒于極早期蛋白是病毒增殖過(guò)程中一類重要調(diào)控因子，對(duì)WSSV極早期基因功能的深入研究有助于揭示W(wǎng)SSV的感染機(jī)制，并能夠?yàn)榭共《舅幬锏脑O(shè)計(jì)奠定理論基礎(chǔ)，為WSSV的防治，減少對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成損失作出貢獻(xiàn)。

［1］ 姚泊, 何建國(guó). 白斑綜合癥桿狀病毒對(duì)對(duì)蝦和羅氏沼蝦致病性的研究［J］. 廣州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2002, 1（1）：35-39.

［2］ 馬曉燕, 李鵬, 嚴(yán)潔. 對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的概述［J］. 南京師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2012, 35（4）：90-101.

［3］ Sanchez-Paz A. White spot syndrome virus：an overview on an emergent concern［J］. Vet Res, 2010, 41（6）：43.

［4］ Smith MC, Boutell C, Davido DJ. Hsv-1 Icp0：paving the way for viral replication［J］. Future Virology, 2011, 6（4）：421-429.

［5］ Liu WJ, Chang YS, Wang CH, et al. Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximide-treated shrimp［J］. Virology, 2005, 334（2）：327-341.

［6］ Li F, Li M, Ke W, et al. Identification of the immediate-early genes of white spot syndrome virus［J］. Virology, 2009, 385（1）：267-274.

［7］ Lin F, Huang H, Xu L, et al. Identification of three immediate-early genes of white spot syndrome virus［J］. Archives of Virology, 2011, 156（9）：1611-1614.

［8］ Liu WJ, Chang YS, Huang WT, et al. Penaeus monodon TATA Box-binding protein interacts with the white spot syndrome virus transactivator IE1 and promotes its transcriptional activity［J］. J Virol, 2011, 85（13）：6535-6547.

［9］ Ran X, Bian X, Ji Y, et al. White spot syndrome virus IE1 and WSV056 modulate the G1/S transition by binding to the host retinoblastoma protein［J］. J Virol, 2013, 87（23）：12576-12582.

［10］ Chen AJ, Gao L, Wang XW, et al. SUMO-conjugating enzyme E2 UBC9 mediates viral immediate-early protein SUMOylation in crayfish to facilitate reproduction of white spot syndrome virus［J］. J Virol, 2013, 87（1）：636-647.

［11］ Lu H, Ruan L, Xu X. An immediate-early protein of white spot syndrome virus modulates the phosphorylation of focal adhesion kinase of shrimp［J］. Virology, 2011, 419（2）：84-89.

［12］ Wang Z, Chua HK, Gusti AA, et al. RING-H2 Protein WSSV249 from white spot syndrome virus sequesters a shrimp ubiquitinconjugating enzyme, PvUbc, for viral pathogenesis［J］. Journal of Virology, 2005, 79（14）：8764-8772.

［13］ He F, Kwang J. Identification and characterization of a new E3 ubiquitin ligase in white spot syndrome virus involved in virus latency［J］. Virol J, 2008, 5：151.

［14］ He F, Ho Y, Yu L, et al. WSSV ie1 promoter is more efficient than CMV promoter to express H5 hemagglutinin from influenza virus in baculovirus as a chicken vaccine［J］. BMC Microbiology, 2008, 8（1）：238.

［15］ Schindler C, Darnell Jr J. Transcriptional responses to polypeptide ligands：the Jak-STAT pathway［J］. Annual Review of Biochemistry, 1995, 64（1）：621-652.

［16］ Dostert C, Jouanguy E, Irving P, et al. The Jak-STAT signaling pathway is required but not sufficient for the antiviral response of drosophila［J］. Nat Immunol, 2005, 6（9）：946-953.

［17］ Chen WY, Ho KC, Leu JH, et al. Wssv infection activates stat in shrimp［J］. Developmental & Comparative Immunology, 2008, 32（10）：1142-1150.

［18］ Liu WJ, Chang YS, Wang AH, et al. White spot syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the immediateearly gene IE1［J］. J Virol, 2007, 81（3）：1461-1471.

［19］ Sun L, Liu L, Yang XJ, et al. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of Myod and muscle differentiation［J］. Journal of Cell Science, 2004, 117（14）：3021-3029.

［20］ Ma G, Yu L, Wang Q, et al. Sf-PHb2, a new transcription factor, drives WSSV IE1 gene expression via a 12-bp DNA element［J］. Virology Journal, 2012, 9（1）：206.

［21］ Hayden MS, Ghosh S. Signaling to NF-κB［J］. Genes & Development, 2004, 18（18）：2195-2224.

［22］ Wang PH, Gu ZH, Wan DH, et al. The shrimp IKK-NF-κB signaling pathway regulates antimicrobial peptide expression and may be subverted by white spot syndrome virus to facilitate viral gene expression［J］. Cell Mol Immunol, 2013, 10（5）：423-436.

［23］ Huang XD, Zhao L, Zhang HQ, et al. Shrimp NF-κB binds to the immediate-early gene IE1 promoter of white spot syndrome virus and upregulates its activity［J］. Virology, 2010, 406（2）：176-180.

［24］ Liu WJ, Chang YS, Wang HC, et al. Transactivation, dimerization, and DNA-binding activity of white spot syndrome virus immediateearly protein IE1［J］. J Virol, 2008, 82（22）：11362-11373.

［25］ Cormack BP, Struhl K. The TATA-binding protein is required for transcription by all three nuclear RNA polymerases in yeast cells［J］. Cell, 1992, 69（4）：685-696.

［26］ Horikoshi N, Maguire K, Kralli A, et al. Direct interaction between adenovirus E1A protein and the TATA box binding transcription factor IID［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88（12）：5124-5128.

［27］Lieberman PM, Berk AJ. The Zta trans-activator protein stabilizes TFIID association with promoter DNA by direct protein-protein interaction［J］. Genes & Development, 1991, 5（12b）：2441-2454.

［28］ Sun A, Bagella L, Tutton S, et al. From G0 to S phase：a view of the roles played by the retinoblastoma（Rb）family members in the Rb-E2f pathway［J］. Journal of Cellular Biochemistry, 2007, 102（6）：1400-1404.

［29］ Polager S, Kalma Y, Berkovich E, et al. E2fs up-regulate expression of genes involved in DNA replication, DNA repair and mitosis［J］. Oncogene, 2002, 21（3）：437-446.

［30］Huang JY, Liu WJ, Wang HC, et al. Penaeus monodon thioredoxin restores the DNA binding activity of oxidized white spot syndrome virus IE1［J］. Antioxidants & Redox Signaling, 2012, 17（6）：914-926.

［31］ Desterro JM, Rodriguez MS, Kemp GD, et al. Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin-like protein sumo-1［J］. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274（15）：10618-10624.

［32］ Hay RT. Protein modification by sumo［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2001, 26（5）：332-333.

［33］ Tomoiu A, Gravel A, Tanguay RM, et al. Functional interaction between human herpesvirus 6 immediate-early 2 protein and ubiquitin-conjugating enzyme 9 in the absence of sumoylation［J］. J Virol, 2006, 80（20）：10218-10228.

［34］ Marciniak SJ, Ron D. Endoplasmic reticulum stress signaling in disease［J］. Physiol Rev, 2006, 86（4）：1133-1149.

［35］ Schroder M, Kaufman RJ. Er Stress and the unfolded protein response［J］. Mutat Res, 2005, 569（1-2）：29-63.

［36］ Schroder M. Endoplasmic reticulum stress responses［J］. Cell Mol Life Sci, 2008, 65（6）：862-894.

［37］ Li XY, Pang LR, Chen YG, et al. Activating transcription factor 4 and X box binding protein 1 of Litopenaeus vannamei transcriptional regulated white spot syndrome virus genes Wsv023 and Wsv083［J］. PloS One, 2013, 8（4）：e62603.

［38］Ciechanover A, Orian A, Schwartz AL. Ubiquitin-mediated proteolysis：biological regulation via destruction［J］. Bioessays, 2000, 22（5）：442-451.

［39］ Borden KL. Ring domains：master builders of molecular scaffolds?［J］. J Mol Biol, 2000, 295（5）：1103-1112.

［40］ Torii KU, Stoop-Myer CD, Okamoto H, et al. The RING finger motif of photomorphogenic repressor COP1 specifically interacts with the RING-H2 motif of a novel Arabidopsis protein［J］. J Biol Chem, 1999, 274（39）：27674-27681.

［41］ Thomas M, Pim D, Banks L. The role of the E6-P53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV［J］. Oncogene, 1999, 18（53）：7690-7700.

［42］ Lin F, Huang H, Ke W, et al. Characterization of white spot syndrome virus immediate-early gene promoters［J］. Journal of General Virology, 2013, 94（2）：387-392.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Review of Development in WSSV Immediate-early Gene Research

Ran Xiaozhuo Li Fang
（Third Institute of Oceanography，Key Laboratory of Marine Genetic Resourse，State Ocean Administration，Xiamen 361005）

White spot syndrome virus is one of the main pathogens which causes great damage to the shrimp aquaculture. During the infection, WSSV immediate-early genes（IE genes）utilize the host cell transcription regulators to increase their own transcription. Regulatory proteins encoded by IE genes are critical for the virus life cycle. The IE proteins may either regulate the expression of viral genes, or interact with regulators in the host cells to create a proper environment for viral replication. Here we reviewed the recent progress in WSSV IE gene research and especially focused on five most-studied WSSV immediate-early genes：ie1, wsv051, wsv083, wsv249 and wsv403. The function of IE proteins and the transcription regulation of their genes were discussed.

WSSV immediate-early genes ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

2013-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41276176）

冉曉卓，男，碩士研究生，研究方向：對(duì)蝦白斑綜合癥病毒極早期基因；E-mail：absolut21@126.com

李鈁，女，副研究員，研究方向：對(duì)蝦白斑綜合癥病毒極早期基因；E-mail：lifang@tio.org.cn