人內皮素受體A基因克隆及表達

潘曉菲時麗麗譚初兵呂超君徐為人湯立達

（1.天津醫科大學基礎醫學院，天津 300070；2.天津藥物研究院 天津市新藥設計與發現重點實驗室，天津 300193）

人內皮素受體A基因克隆及表達

潘曉菲1時麗麗2譚初兵2呂超君1徐為人2湯立達2

（1.天津醫科大學基礎醫學院，天津 300070；2.天津藥物研究院 天津市新藥設計與發現重點實驗室，天津 300193）

為了建立內皮素受體拮抗劑篩選系統，克隆人ETA基因，構建真核表達載體，并實現pTag-Lite SNAP-ETA在CHOK1細胞中的瞬時表達。從人肺腺癌細胞系A549中克隆人ETA基因，連接到pTag-Lite SNAP質粒，構建表達載體pTag-Lite SNAPETA，用FuGENERHD轉染試劑將表達載體pTag-Lite SNAP-ETA轉染入CHO-K1細胞內，通過熒光顯微鏡檢測融合蛋白SNAP-ETA的表達。DNA測序結果表明pTag-Lite SNAP-ETA表達載體構建成功，熒光顯微鏡檢測結果表明人ETA在CHO-K1細胞中有效表達。

內皮素受體A RT-PCR pTag-Lite SNAP載體 CHO-K1細胞 表達

內皮素（Endothelin，ET）是一種含有21個氨基酸的多肽，是目前已知的作用最強和效應最持久的血管活性肽，有強烈的血管收縮和促平滑肌細胞遷移、增殖作用，廣泛作用于體內多系統，有ET-1、ET-2、ET-3三種亞型，與高血壓、充血性心力衰竭、糖尿病、癌癥及纖維化等有著密切聯系。內皮素主要通過與靶細胞膜上的內皮素受體（Endothelin receptor，ETR）結合后發揮其生物學效應，并在心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和腫瘤等眾多疾病的發生發展中扮演了重要的角色，因此拮抗ET與ETR的相互作用被認為是治療此類疾病的有效治療途徑，而抑制ETR是阻斷ET生理病理學效應的主要手段［1-9］。人的ETR分為ETA和ETB兩亞型，均為G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR），但兩者功能存在差異。ETA被認為是基本的縮血管和促生長受體，ETB在血管系統中抑制細胞生長和血管收縮，因其參與ET-1的清除被稱為“清除受體”。內皮素及其受體多樣性地廣泛分布于各組織，通過不同的亞型和信號傳遞系統介導復雜的生物學效應，與多種心血管系統疾病和糖尿病等有密切聯系［10-13］，其中ETA發揮的作用為主要［14，15］。本研究從人肺腺癌細胞A549中克隆了人ETA基因，將其導入pTag-Lite SNAP質粒中，獲得重組pTag-Lite SNAP-ETA載體，再將其轉染至CHO-K1細胞內，使SNAP-ETA融合蛋白得以表達，為后期ETA的體外研究以及拮抗劑的篩選、活性評價等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及質粒 人肺腺癌細胞系A549和中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1場購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，細胞在37℃、5% CO2、飽和濕度下用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養；pTag-Lite SNAP質粒（Tag-liteTMSNAP-plasmid）由中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心饋贈。

1.1.2 試劑 限制性核酸內切酶、primerSTARHSDNA聚合酶、T4DNA連接酶和DNA Marker均購自大連寶生物公司（日本TaKaRa公司）；PCR純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京原平皓生物技術有限公司；PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit、大腸桿菌Top10感受態細胞和無內毒素質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由華大基因科技服務有限公司合成；Trizol，胰蛋白酶購自天津市聯星生物技術有限公司；FuGENE? HD Transfection Reagent購自美國Promega公司；SNAPCell Fluorescein購于美國NEB公司；其他均為國產或進口分析純。

1.1.3 培養基 大腸桿菌培養基：蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自美國Oxoid公司，固體培養基中添加1.5%的瓊脂；細胞培養基：DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 Trizol法提取總RNA 選取生長態勢良好的A549細胞，用Trizol法提取總RNA，將提取總RNA加入紫外板，稀釋后酶標儀測定OD260/ OD280，確定總RNA的純度及濃度。

1.2.2 RT-PCR擴增ETAcDNA 以上述提取的細胞總RNA為模板，按照PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit使用說明書進行cDNA逆轉錄，逆轉錄條件為37℃，60 min；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測逆轉錄結果，置-20℃儲存備用。

1.2.3 擴增ETA基因 根據GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列，使用Oligo軟件，設計擴增ETA的引物（表1）。以前期獲得的cDNA為模板，分別擴增ETA基因片段，反應條件為98℃，2 min；98℃，10 s；68℃，80 s；30個循環后72℃，10 min；4℃儲存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.2.4 構建pTag-Lite SNAP-ETA表達載體 對提取的pTag-Lite SNAP質粒和回收的ETA基因片段，進行ApaI和XhoI雙酶切；切膠回收酶切產物，按載體與片段1：5的摩爾濃度，T4連接酶22℃連接2 h；連接產物轉化感受態E.coliTOP10，利用氨芐霉素進行抗生素篩選轉化子；通過ApaI和XhoI雙酶切及菌落PCR鑒定質粒，挑取陽性質粒送測序，獲取重組表達載體SANP-ETA，構建流程如圖1所示。

1.2.5 定點突變ETA基因 經數次基因測序鑒定，從A549細胞系獲得的ETA基因在第343（G-A）、964（C-A）、1 225（A-G）位點有3處突變，根據測序結果設計定點突變引物（表1）。定點突變PCR條件：94℃，3 min；98℃，10 s；50℃，5 s；72℃，8 min；30個循環后72℃，10 min；4℃儲存。T4連接酶連接純化后的PCR產物，DpnI酶切去除模板質粒，轉化入E. coliTOP10感受態細胞中，涂布在含有氨芐篩選抗性的固體培養板上，選取幾株搖菌送測序（由北京六合華大基因科技股份有限公司測序鑒定），依次將3個位點全部突變回正常的基因序列。

1.2.6 提取pTag-Lite SNAP-ETA無內毒素質粒 分別接種TOP10：pTag-Lite SANP-ETA菌株，37℃，200 r/min，過夜培養；收集菌體，按照天根無內毒素質粒大提試劑盒使用說明書操作，提取pTag-Lite SNAP-ETA無內毒素質粒。將提取質粒加入紫外板，酶標儀測定OD260/ OD280，確定質粒純度與濃度。

1.2.7 轉染CHO-K1細胞 培養生長態勢良好的CHO-K1細胞，待其融合度為80%-90%時用胰酶消化成單細胞懸液，按每孔4×104細胞密度接種于96孔板內；待細胞生長至融合度80%-90%時，依據FuGENE? HD說明書進行操作，將pTag-Lite SNAPETA質粒分別瞬時轉染到CHO-K1細胞內，37℃，5% CO2條件下繼續培養24 h。

1.2.8 熒光顯微鏡檢測SNAP-ETA融合蛋白表達 轉染24 h后，棄原培養基，用含5 μmol/L SNAP-tag底物的細胞培養基在37℃，5% CO2條件下繼續培養30 min。用無血清細胞培養基沖洗細胞3次，再用無血清培養基孵育30 min，棄掉培養基，在倒置熒光顯微鏡下拍照，激發波長為500 nm，發射波長為532 nm。

2 結果

2.1 總RNA的提取

從人肺癌細胞A549中提取總RNA，測定的OD260/OD280值位于1.8-2.0之間，說明所提取的RNA純度較高，無DNA和蛋白污染。經過瓊脂糖凝膠電泳驗證（圖2），顯示提取的總RNA無雜帶，未見明顯降解，也無DNA污染，總RNA完整性較好。

2.2 人ETA基因的克隆

GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列大小分別為1 284 bp。以上述提取的A549總RNA為模板，通過RT-PCR獲得ETA基因PCR產物，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示克隆到了約1 300 bp大小的條帶（圖3），與目的條帶大小基本一致。

2.3 pTag-Lite SNAP-ETA質粒構建及鑒定

利用ApaI和XhoI雙酶切位點將ETA基因片段連接入pTag-Lite SNAP質粒上，轉化入E.coliTOP10感受態細胞內，搖菌并接種于含氨芐霉素抗性篩選基因的平板上，過夜進行菌落PCR鑒定，并對菌落PCR陽性結果提取質粒進行雙酶切驗證（圖4），將陽性克隆子送測序。經過數次測序結果顯示pTag-Lite SNAP-ETA載體出現3處突變（圖5-A），分別位于343（G-A），964（C-A）和1225（A-G）位，并影響其編碼的氨基酸序列。利用定點突變原理依次對ETA進行定點突變，最后測序結果（圖5-B）顯示突變成功，pTag-Lite SNAP-ETA載體序列與目的序列一致。

2.4 熒光顯微鏡檢測SNAP-ETA融合蛋白的表達

將CHO-K1細胞接種入黑色96孔板內，用FuGENE轉染pTag-Lite SNAP-ETA表達載體，同時設置未轉染對照組，轉染24 h后用SNAP-tag底物孵育CHO-K1細胞，經SNAP-tag底物處理的細胞在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結果顯示，沒轉化的細胞未見紅色熒光（圖6 -C），而轉染pTag-Lite SNAPETRA（圖6-D）的細胞可見紅色熒光，證明SNAPETA融合蛋白在CHO-K1細胞內有效表達；與普通顯微鏡照片（圖6-B）相比，SNAP-ETA融合蛋白表達量較大。

3 討論

ETR廣泛表達于人體的各組織器官，不僅存在于血管和支氣管平滑肌，在心肌、肺臟、腎臟、腎上腺、腦、眼、腸等組織中也有不同亞型和不同密度的ETR分布。ETR與心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和癌癥等眾多疾病的發生發展有著密切的聯系［12，16］。目前，阻斷ETR（主要針對ETA）被認為是治療高血壓，尤其是肺動脈高壓（Pulmonary artery hypertension，PAH）較有效的手段。內皮素受體拮抗劑分為肽類和非肽類兩種類型：肽類ETR拮抗劑對ETA、ETB無選擇性，半衰期短、生物利用度低，口服吸收不良，臨床應用的療效不理想。非肽類ETR拮抗劑半衰期較長，口服吸收良好，目前成為主要研發的方向。目前已經上市的內皮素受體拮抗劑有波生坦、西他生坦和安倍生坦，均為治療肺動脈高壓的藥物［17］。馬西替坦在肺動脈高壓治療中表現出良好臨床療效以及良好的耐受性［18，19］，其開發已進入注冊階段。然而波生坦因用藥量大、藥物相互作用多以及肝臟毒性等缺點，其應用受到限制［17］，西他生坦更是因其致死性肝臟損傷于2010年撤市?，F有的藥物對肺動脈高壓以及其他相關疾病的治療遠遠不夠，還需要尋找更多安全有效的藥物。解決此問題，建立快捷方便的篩選方法是加快尋找ETR拮抗劑比較有效的途徑。

為建立ETA特異的拮抗劑篩選系統，本研究成功地從A549細胞RNA中克隆了人ETA基因，并采用了真核表達載體pTag-lite SNAP作為載體質粒，融合表達了SNAP-ETA蛋白。Tag-lite是SNAP-Tag與HTRF技術相結合用來進行細胞表面受體分析的一種技術［20］。SNAP是小的融合標簽蛋白，可以非常容易地融合到目標蛋白的N端，又可特異性地與底物通過芐甲基不可逆共價結合，底物可與各種染料形成衍生物，這樣就可以通過對底物進行熒光標記進而定位目標蛋白。另外，當底物與HTRF熒光染料反應形成衍生物，SNAP-ETA融合蛋白通過與底物特異結合被標記，這時加入受體熒光染料標記的配體，就可以根據試驗目的進行受體配體結合、ETA異源二聚化試驗、寡聚化試驗以及內源化試驗等細胞表面受體分析［20］。以此原理建立的ETA拮抗劑篩選模型信噪比強，靈敏度高，并可實現高通量篩選。

4 結論

本研究成功構建了pTag-Lite SNAP-ETA真核表達載體，并完成在CHO-K1細胞內瞬時表達，為ETA的體外研究及其拮抗劑篩選、活性評價等與之相關研究提供了新的方法。

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（責任編輯 李楠）

Clone and Expression of Human ETA

Pan Xiaofei1Shi Lili2Tan Chubing2Lü Chaojun1Xu Weiren2Tang Lida2
（1. Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070；2. Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193）

It was to facilitate inhibitor screening of endothelin receptor, cloning of human endothelin receptor geneETA, construction of eukaryotic expression vectors and transient expression of pTag-Lite SNAP-ETAin CHO-K1 cells. Method HumanETAgene fragment were amplified from human lung cancer cell line A549 via RT-PCR and inserted into pTag-Lite SNAP plasmid, the recombinant plasmids were then transiently transfected into CHO-K1 cells using FuGENE? HD, expression ofETAwas observed via fluorescence microscope. Result Sequencing result showed pTag-Lite SNAP-ETAexpression vector were correctly constructed. Fluorescence microscope images indicated that two vectors were expressed in CHO-K1 cells.

human endothelin receptor gene RT-PCR pTag-Lite SNAP CHO-K1 cell expression

2013-08-12

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（12JCYBJC18800），國家“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09105102，2011ZX-09401-009）

潘曉菲，女，碩士研究生，研究方向：藥理學；E-mail：sumu7@126.com

時麗麗，女，助理研究員，博士，研究方向：藥理學及新藥發現，E-mail：shill@tjipr.com；湯立達，男，研究員，博士生導師，博士，研究方向：心血管藥理學及藥物創新設計，E-mail：tangld@tjipr.com